私たちは、議論のためのマティアス·S.ディック、ローランドF.ドライアとセバスチャンリュールを承認したいと思います。この作品は、PBにSNSF教授職PP00P3_139120 / 1と大学バーゼルのプロジェクトグラントID2153162によってサポートされていました

mCherryを発現するサルモネラ （FACSベースの分析）1.ジギトニンアッセイ<ol><li>細菌の準備 注：プラスミドからmCherryをを発現するサルモネラ野生型SL1344は（ストレプトマイシン耐性）（pFPVがrpsMプロモーター下mCherryををコードする）は、このアッセイで使用されています。 mCherryを（データは示していない）16の構成的発現によって改変されない細菌の食作用及び増殖。 <ol><li> 37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）およびアンピシリン（100μgの/ mlの、mCherryを発現するベクター）を補充したLB培地3mlでの感染の前に歪み1日に接種。 </li></ol></li><li>感染のために細胞をプレーティングします。 <ol><li> 1.25×10 5細胞の密度で24ウェルプレート内での種子野生型BMDMs /ウェルの一次マクロファージ培地1ml中では（DMEM、10％ウシ胎児血清（FCS、熱不活性化、56℃、30分を補っ）、1％HEPES、1％非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清（マクロファージコロニー刺激因子（M-CSFからの馴化培地）L929細胞を産生します）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。コントロール（ 表1）として使用するウェルにカバースリップを追加します。 </li><li> 37℃のインキュベーター中で一晩細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2">透過化</td><td colspan="3">染色</td></tr><tr><td></td><td>ガラスカバースリップ</td><td>サルモネラ</td><td>ジギトニン</td><td>サポニン</td><td>抗サルモネラ</td><td>抗カルネキシン</td><td>抗PDI </td></tr><tr><td> A1（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4（無透過性制御） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5（完全透過性制御） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1（染色）PDIのため</td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2（PDIについて染色） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3（PDIについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 表1：サルモネラ、透過性、および染色によるその後の感染の24ウェルフォーマットでの骨髄由来マクロファージ（BMDMs）用メッキ方式 *プロトコル1またはプロトコル2が行われているかどうかに応じ。 <ol start="3"><li>感染細菌の準備。 <ol><li>次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することにより、一晩培養でサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600が Lで測定されることを保証します分光光度計のinear範囲。 </li><li> 1ml当たりのサルモネラの濃度を計算します。 1のOD600は、1×10 9細菌に相当します。 </li><li> 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。 </li></ol></li><li> サルモネラ菌による細胞の感染。 <ol><li> BMDMsからメディアを取り出します。非感染対照ウェル（B1〜B3、C1〜C3）にマクロファージ培地1mlを加えます。ウェルA1にサルモネラ懸濁液1mlを加える- A5は、セル当たり10の細菌の感染（MOI）の多数に到達します。 </li><li>感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。 <ol><li> 1時間の感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、0.1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します細胞外細菌を殺すために。すべてのセルが同じように扱われることを保証するために、さらに非感染対照に、すべてのウェルにゲンタマイシンを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>細胞を洗浄。 <ol><li> （37℃に予め温めておいた）を10μg/ mlを含む2時間の感染後、インキュベーターからプレートを取り外し、すべてのウェルは、プレーン1mlのDMEMで2回（37℃に予熱した）およびマクロファージ培地と交換し洗う​​時&#160;残りの細胞外細菌の増殖を防止するためにゲンタマイシン。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。 <ol><li>ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、作業濃度にKHMバッファに希釈しますジギトニンを50μg/ mlの。また、KHMに1/100で1/100または抗PDIで1/500、抗カルネキシンでKHM緩衝液中0.1％サポニンの溶液を調製し、抗FITCに結 ​​合されたサルモネラ抗体（CSA-1-FITC）バッファは、3％BSAを添加しました。 </li></ol></li><li>細胞透過。 <ol><li>インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、ウェルA1に井戸A4およびB1 / C1、ジギトニンでKHMバッファにプレーンKHMバッファ0.25ミリリットルを追加-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンとA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。 </li></ol></li><li>一次抗体染色。 <ol><li>適切なウェルに一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ -FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）をKHMバッファを削除し、追加します（ 図1 </st栄&gt; 表1）。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。 </li><li> 1 mLのPBSで1×細胞を洗浄。 </li></ol></li><li>感染細胞（ウェルA1 - A5）：FACS分析<ol><li>洗浄細胞をPBSで3倍、0.1％トリトンを含む氷冷PBSの0.5 mLを加え。細胞凝集体を破壊するためにセルストレーナーキャップ付き5mlのFACSチューブに移します。氷上でサンプルを保管してください。 </li><li> FACSのサンプルを分析します。完全に透過性にコントロールを使用して、全前方に基づく細菌と第一側方散乱（FSC / SSC）のためのゲートを設定し、mCherryを信号（610 nmの±20 nmのフィルター）。 </li><li>次に、サイトゾル細菌（FITC +、mCherryを+）および液胞細菌（FITC-、mCherryを+）（ 図3）のためにゲートを設定するために、完全に透過処理し、透過性にないコントロールを使用して、全細菌集団におけるFITC信号を分析します。 </li><li>ゲートを設定すると、サンプルを分析し、サイトゾル対の割合を決定します製造業者のプロトコルに従ってFlowJoソフトソフトウェアを使用して液胞の細菌。 </li></ol></li><li>感染していない透過性のコントロール（ウェルB1 - B3、C1 - C3）：顕微鏡<ol><li>固定<ol><li> PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。 </li></ol></li><li>二次抗体染色。 <ol><li> PBS中のフルオロフォアに結合さ適切な二次抗体と室温で1時間染色透過コントロールは、0.1％サポニンおよび3％BSAを完全に透過性細胞を補充しました。 </li><li>洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>顕微鏡分析。 <ol><li>共焦点FLUOを使用して、40Xや63X倍率でコントロールでカバースリップを分析rescence顕微鏡。透過性が働いている場合は、非透過性細胞、digitonin-だけサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためのサポニン透過処理した細胞およびPDI染色の両方のためのカルネキシン染色のための染色があってはなりません。 </li></ol></li></ol></li></ol>非標識サルモネラ（顕微鏡ベースの分析）2.ジギトニンアッセイ<ol><li> O / N培養に細菌を準備。 <ol><li>非標識サルモネラ野生型SL1344を接種する（ストレプトマイシン耐性）37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）を補充したLB培地3mlでの感染の前に1日。 </li><li>感染のために細胞をプレーティングします。 <ol><li> 1.25×10 5細胞の密度で滅菌ガラスカバースリップを含む24ウェルプレート中の種子BMDMs /ウェルマクロファージ培地1ml（DMEMを、10％ウシ胎児血清（FCSをデ補完、56°Cを補給して、30分）、1％HEPES、1％L-非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。 </li><li> 37℃のインキュベーター中で細胞をO / Nインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol></li><li>感染細菌の準備。 <ol><li>次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することによって、O / N培養中のサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600は 、分光光度計の直線範囲で測定されることを保証します。 </li><li>ミリリットル当たりサルモネラの濃度を決定します。 1のOD 600が 1×10 9細菌に相当します。 </li><li> 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。 </li></ol></li><li> サルモネラ菌による細胞の感染。 <oL&gt; <li>すべてのウェルから培地を除去します。非感染対照ウェルに平野マクロファージ培地1mlを加える（B1 - B3、C1 - C3）。ウェルA1にサルモネラ懸濁液1mlを加える- A5は、セル当たり10の細菌の感染（MOI）の多数に到達します。 </li><li>感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。 <ol><li> 1時間感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、全てのウェルに細胞外細菌を殺すために1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>細胞を洗浄。 <ol><li> 2時間の感染後に、インキュベーターからプレートを取り外しおよび10μg/ mlを含む新鮮なマクロファージ培地1 mlを各ウェル3回洗います 防止するために、ゲンタマイシン残りの細胞外細菌の増殖。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。 <ol><li>ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、50μg/ mlのの作業濃度にKHMバッファーに希釈 ジギトニン。 </li><li>また、KHMバッファー中で1/100 1/100または抗PDIでKHM緩衝液中の0.1％サポニンの溶液を調製し、抗サルモネラ -FITC（CSA-1、は0.1μg/ mlで）、抗カルネキシンを補っ3％BSA（抗体濃度のための材料の表を参照）。 </li></ol></li><li>細胞透過。 <ol><li>インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、0.25ミリリットルプレーンKHMバッファを追加井戸A4およびB1 / C1、KHMバッファへのウェルA1にジギトニンで-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンでA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。 </li></ol></li><li>一次抗体染色。 <ol><li> KHM緩衝液を除去し、適切なウェル（ 図2、表1）に、一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ CSA1-FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）を追加します。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。 1mlのPBSで洗浄3回。 </li></ol></li><li>固定。 <ol><li> PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。 </li></ol></li><li>合計感染したサンプルのサルモネラ染色 。 <ol><li>洗浄は、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで3回カバースリップ及び抗CSA1抗体とサンプルインキュベート（ヤギ抗CSA1、0.1μgの/ mlで、マウス抗LPS 0.1 / mlの、同様に動作）1時間0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中、室温で。 </li><li> 0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで洗浄3倍。暗所で室温で30分間、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中の選択肢の蛍光団に結合された二次抗ヤギ抗体を使用してサンプルをインキュベートします。 </li><li>洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>顕微鏡分析。 <ol><li>サイトゾルサルモネラ （正の抗サルモネラ -FITC）および全サルモネラ （二重陽性）（ 図5）をカウントすることにより、共焦点顕微鏡を使用してデータを取得します。透過性のコントロールは表示しない必要があります。非透過性細胞、カルネキシンのための染色をサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためにジギトニン透過性細胞及びPDI染色にtaining。ウェルズA4とA5は、 サルモネラ染色のための内部コントロールとして機能します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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We have nothing to disclose.

差動透過性は、液胞コンパートメントと細胞質ゾルの間の細菌性病原体の細胞内分布を分析し、定量化するための簡単​​かつ堅牢な方法です。同じアッセイは、 フランシセラnovicida 2,4および赤痢菌 12のような細菌で正常に使用されています。多くの細胞内病原体が宿主細胞内膜構造を変更したり、変更するので、ジギトニン透過化の堅牢性は、個別に決定す?...

細胞内細菌性病原体は、直接宿主細胞サイトゾル中、または特殊な液胞コンパートメント1のいずれかで複製します。感染の初期段階では、ほとんどの病原体は、（マクロファージなど）、または積極的に非食細胞に自分の取り込みを促進することにより、特殊化した細胞による食作用によっていずれかを内在化を受けます。食細胞は、ファゴソームは、通常、貪食粒子が消化される分解室を形成し、リソソームと融合します。このようなフランシセラnovicidaや赤痢菌などの専門サイトゾル細菌は、ファゴソームの破壊を誘導することにより、ファゴソームの劣化を脱出し、続いて細胞質ゾル2,3に逃げ込みます。これは、液胞破裂2-4を促進するエフェクタータンパク質を注入フランシセラ病原性アイランド（FPI）またはフレクスナー赤痢菌 T3SS、などの病原性に関連するメカニズムが必要です。宿主細胞の細胞質ゾルの機能通常、病原体の存在を認識し、5シグナリング自然免疫を誘導する保存されたパターン認識受容体の数。また、xenophagy、オートファジーの抗菌フォームは、細胞質ゾルに入る細菌を分解することができます。細胞質細菌は、通常、十分に平滑または異なる戦略を使用してこれらの応答を回避するように適合されています。例えば、 フランシセラ、ホスト認識を回避するために、そのLPSを変更し、 赤痢菌が分泌エフェクタータンパク質6,7を使用して、オートファジーの動員を防止します。 リソソーム分解をエスケープする別の戦略は、その後、 ネズミチフス菌と呼ばれるモデル液胞病原体サルモネラエンテリカ血清型のネズミチフス菌によって採用されている。 サルモネラ菌はサルモネラ含有液胞（SCV）、その細胞内ニッチに初期ファゴソームを改造エフェクターを注入するT3SSを使用しています8,9。ホスト経路の連続的な操作であります液胞に脂質および他の栄養素を補充することによって、この空胞を維持するために必要。実際、 サルモネラのSIFA変異体は液胞の安定性を維持するために失敗し、先天性免疫経路とオートファジーの動員8の活性化をもたらす感染後時間以内に宿主細胞の細胞質ゾルに入ります。 サルモネラの液胞エスケープ研究である細胞型に依存して変化し、いくつかの報告は、上皮細胞においてさえWT サルモネラ細胞質10にSCVとhyperreplicateを逃れることができることを示しています。最近の報告では、液胞の病原体の自然免疫検出はまた、認識し、病原体含有液胞（のPCV）11-14を不安定化するホストの能力に依存することを示しています。 ホストまたは細菌の遺伝子型の両方が液胞および細胞質コンパートメント間の細胞内細菌の分布に影響を与えることができることを考えると、それは液胞対の数を定量化することが必要ですサイトゾル細菌。以来、ほとんどの実験的な設定で、宿主細胞は、異なる細胞内区画内の複数の細菌を保有することができ、その後、複数の細菌に感染され、この技術は、単一の細菌のレベルで定量化を可能にすることが必要とされます。 （また、ファゴソーム保護アッセイとして知られている）は、差動透過性は、この解像度2,4,10,12を提供します。アッセイは、無傷の液胞の膜を残す洗剤ジギトニン、を有する宿主細胞の原形質膜の選択的透過性に基づいており、したがって、抗体と細胞質の細菌の選択的染色を可能にします。ここでは、差動透過性を使用して、サイトゾルおよび液胞ネズミチフス菌の定量化のための2つのプロトコルを提供します。この方法の原理を図1に記載されている：骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は固定相mCherryを発現サルモネラ菌に感染しています。固定相サルモネラトンを必要とします彼らは活動さもなければNLRC4のソームによって認識され、BMDMs 15の急速な細胞死（pyroptosis）を誘発することになるSPI-1 T3SSの発現をダウンレギュレートするため、O使用すること。続いて感染細胞を洗浄し、1分間ジギトニンを50μg/ mlので処理します。細胞を直ちに再び洗浄し、細胞質ゾルへのアクセスを、細菌をマークするためにFITCに結 ​​合された抗サルモネラ抗体と共にインキュベートします。追加の洗浄工程の細胞を溶解しそしてmCherryを+（液胞型）およびFITC + / mCherryを+（サイトゾル）細菌の割合をFACSによって決定された後。また、何の蛍光タンパク質を発現する株は（ 図2）が利用できない場合に使用することができるこの方法の適応を報告しています。追加の手順は、細胞を固定し、完全に透過処理されたFITC標識後に導入されています。その後、全ての細菌は、抗サルモネラ抗体および対応する二次抗体で染色します。 DETectionは、代わりにFACS解析の顕微鏡検査によって行われます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

細胞内細菌性病原体は、細胞質ゾル中または特殊な病原体含有液胞（のPCV）で複製することができます。細胞質ゾルに到達するには、 フレクスナー赤痢菌とフランシセラnovicidaなどの細菌は、ファゴソームの破壊を誘導する必要があります。これとは対照的に、 ネズミチフス菌はサルモネラ含有液胞（SCV）として知られている液胞コンパートメントに複製されます。しかし、 サルモネラ菌の特定の変異体は、SCVの完全性を維持することができないので、細胞質ゾル中に放出されます。単一の細菌のレベルで液胞細菌対細胞質ゾルの割合は、ファゴソーム保護アッセイとして知られている、差動透過化することによって測定することができます。アプローチは、選択的にコレステロールを結合するための洗剤ジギトニンの性質を利用しています。細胞膜は、他の細胞膜よりもコレステロールを含んでいるので、ジギトニンが細胞内膜を残して選択的に細胞膜を透過するのに使用することができます無傷。簡潔には、蛍光マーカータンパク質（ 例えば mCherryをとりわけ）を発現する病原体による感染後、宿主細胞の原形質膜は、緩衝液を含むジギトニンで短いインキュベーションで透過されます。次いで、細胞を洗浄し、培養し、任意の細菌に対して向け（お好みの蛍光団に結合された）一次抗体（ 例えば抗サルモネラ -FITC）し、再び洗浄します。マークされていない細菌が使用される場合、追加のステップがあるすべての膜を透過処理され、すべての細菌は、対応する抗体で染色し、実施することができます。染色後、液胞および細胞質細菌の割合は、単一または二重陽性事象をカウントすることによって、FACSまたは顕微鏡により定量することができます。ここでは、菌、ネズミチフス菌でこの技術を使用するための実験の詳細を提供します。このアッセイの利点は、他のアッセイとは対照的に、それは、単一bacteのレベルで定量化を提供することですRIA、顕微鏡で分析した場合に、所定の細胞における細胞質ゾルおよび液胞細菌の正確な数を提供します。

図1と図2は、プロトコル1とプロトコル、得られた結果で重要なステップを示すプロトコル2で説明したジギトニンアッセイの概略図を示す。 図3は、典型的なFACSの結果を示しています。正および負の対照は、mCherryを+ / FITC-細菌（液胞サルモネラ ）とmCherryを+ / FITC +細菌（細胞質ゾルサルモネラ ）のためにゲートを設定するために使用されています。これら...

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Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K ビュー.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

免疫・感染学

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

液胞対細胞質の定量化

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細胞質のCaの測定^{2 +}絶縁収縮リンパ管における