我々のプロトコルは、免疫刺激因子、GM-CSFを発現する胚性幹細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞を生成するために使用することができる。外因性の富化した細胞外小胞は、GM-CSFを担い、免疫応答を調節できる無細胞免疫調節小胞を提供する可能性を有する。基本的な分子および細胞生物学の訓練を受けた研究者, このプロトコルのように簡単にできるはずです, しかし、初めてこのプロトコルを実行する人は、密接に指示に従う必要があります.
私たちのプロトコルは複雑であるため、各ステップの複雑な詳細を視覚化することは、他の研究者がエキソソームフリーFBSを生成し、FBSの所望の体積を超遠回しにし、外生フリー上清を収集するのに役立ちます。ESD 3個の細胞をめっきする前に、室温で15センチメートルの組織培養皿を室温で30分間コーティングします。ESDのフィーダー層細胞を含まないESD細胞を吸引して培養し、5%の炭酸ガス加湿インキュベーターで37°Cの細胞培養液を細胞が90%合流するまで培養した。
1皿あたり0.05%トリプシンの5ミリリットルで、新鮮なトリプシンで摂氏37度で5分間のインキュベーションを行い、ほぼコンフルエントな文化を洗います。インキュベーションの終わりに遠心分離管に分離した細胞を引っ張り、新鮮な培養培地の5ミリリットルでトリプシンを不活性化.遠心分離によって細胞を沈降し、過越のために数える新鮮な媒体でパレットを再中断し、 細胞培養後3ミリリットルの新しいゼラチンコーティングプレート上のESDの3細胞の5倍の10~6番目の細胞を3日間培養してから3日間培養し、外因性豊約細胞外小胞板を10回から7番目のESD3細胞に1回採取する。新しいゼラチンコーティングプレートにつきミリリットルの細胞培養培地は、細胞培養上清を収集する前に3日間、外因性の余分な細胞小胞の分離のために、最初の沈降は遠心分離によってESD3細胞を培養した72時間培養した上清内の大細胞断片を沈降させる。
上清を収集した後、Ultra遠回しにサンプルを採取し、上清を捨てます。メーカーの指示によると、各パレットを1回のPBSで2回洗浄して残留培養上清を除去し、ビチンコニン酸アッセイで外因性豊結細胞外小胞タンパク質含有量を定量化する。その後、PBSの外因性豊量な細胞外小胞をマイクロメートル濃度あたり6マイクログラムで再中断し、摂氏80度で貯蔵する。
透過電子顕微鏡法により外因性富化細胞外小胞を可視化し、室温で2%電子顕微鏡グリッドパラホルムアルデヒドの最終濃度で細胞外小胞の1ミリリットル当たり3〜5マイクログラムを2時間固定した。インキュベーションの最後に、固定サンプルの10マイクロリットルをカーボンサポートフィルムで銅グリッドに1分間ロードしてから、フィルターペーパーでグリッドを排出し、メーカーのプロトコルに従って適切な染色液でグリッドにとどまり、ピンセットを使用してグリッドをフィルターペーパーに転送します。 その後、透過型電子顕微鏡を50,000倍の倍率で使用し、標準的なプロトコルに従って電子顕微鏡画像を取得します。全細胞抽出物を調製するために、示されているように培養物からESD3細胞を採取し、採取した細胞をPBSで再中断してカウントする。
2回目の遠心分離の後、0.5%SDS濃度を含むSDSページローディングバッファのマイクロリットル当たり3番目の細胞に5倍10回の細胞を再中断し、10%振幅のソニケーターでサンプルを10秒間超音波処理します。その後、サンプルを摂氏100度で5分間加熱します。エキソソーム濃縮された細胞外小胞のリセートを調製するには、0.5%SDSを含むSDSページ負荷バッファーの外皮濃縮細胞外小胞をマイクロリットル1.2マイクログラムで再中断し、サンプルを10秒間超音波処理し、サンプルを100°Cで5分間加熱します。
ウェスタンブロット分析では、10マイクロリットルの卸用抽出物とエキソソーム濃縮細胞外小胞リセートサンプルを、最良のストレスページゲルの個々のウェルにロードします。実行の最後に、PVDF膜にタンパク質を移し、目的の適切な一次および二次抗体で膜をインキュベートし、強化された化学発光検出キットを使用してタンパク質発現を検出する、メーカーの指示に従う。エキソソーム濃縮細胞外小胞内のGM-CSFの量を評価するには、キットのマウスGM-CSFを使用して次に抗GM-CSF捕捉抗体でELISAプレートをコーティングし、100マイクロリットルのPBSでエキソソーム濃縮細胞外小胞サンプルの0.6マイクログラムを治療するか、PBSに加えて0.05%tween 20を室温で30分間室温で処理します。
インキュベーションの終わりに、処理したサンプルを調製したELISAプレートの個々のウェルに、室温で1時間インキュベーションし、その後にPBS単独で適切な対応するウェルの洗浄、またはPBSプラス0.05%トゥイーン20を加える。洗浄後、検出抗体をサンプルに加えて、室温で1時間インキュベーションし、PBS単独で洗浄し、PBSに0.05%トゥイーン20を加え、アビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを室温で30分間インキュベーションし、続いて450ナノメートルのマイクロプレートリーダーで各ウェルウェルの吸光度を洗浄して測定します。空のベクターを発現するESD3細胞株またはESD 3細胞株を発現するGM-CSFのGFP蛍光強度は、親の細胞株よりもはるかに高い。
ELISAは、GM-CSFを発現するESD3細胞が、空のベクターコントロール細胞よりも細胞培養上清において著しく高いレベルのGMCSFを産生することを明らかにした。さらに、3細胞を発現するGM-CSFで生成されるGM-CSFの量は、GM-CSFを発現するSTO線維芽細胞によって生成されるものと同様である。細胞外小胞を導入したベクターから分離した透過電子顕微鏡と、GM-CSFの細胞培養により、予想される直径30~100ナノメートルの範囲内に収まる、異なるサイズの小胞が明らかになります。
CD81、アネキシンVおよびフロチリン-1を含むエキソソームマーカーの発現は、細胞外小胞で顕著に増強され、ウェスタンブロット分析による対応する卸売抽出物と比較してESD 3細胞から単離される。重要なことに、ESDに他の細胞下コンパートメントマーカーの存在は、小胞体小胞、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、ミトコンドリアマーカー、チトクロムCおよびオックスホス複合IVサブユニットIVおよび細胞質マーカーGAPDHを含む、3つの細胞外小胞を検出しなかった。0.05%トゥイーン20で洗浄した後、コントロール細胞外小胞で検出されたGM-CSFレベルの背景が有意に低下した。
これに対し、GM-CSF発現細胞の細胞外小胞中のGM-CSFレベルは、トゥイーン20によって有意に増加した。GMCSFを運ぶ高品質のエキソソーム富化細胞外小胞を獲得することは、このプロトコルの成功のための最も重要なステップです。研究者は、GM-CSF依存性細胞株および動物の研究など、GM-CSFを世話する外因性豊かな細胞外小胞が無細胞免疫調節小胞として機能できるかどうかを判断するなどの追加の実験を行うことができる。
これらの外因性豊かな細胞外小胞は、免疫応答の調節が異なる疾患状態にどのように影響するかを探求するために使用することができる。
