Protokolümüz, immün uyarıcı faktör olan GM-CSF'yi ifade eden embriyonik kök hücrelerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziküller üretmek için kullanılabilir. GM-CSF taşıyan eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinler, bağışıklık tepkisini modüle edebilecek hücresiz bir bağışıklık düzenleyici veziklinlere hizmet etme potansiyeline sahiptir. Temel moleküler ve hücresel biyoloji eğitimine sahip araştırmacılar, bu protokol gibi kolayca yapabilmeli, ancak bu protokolü ilk kez gerçekleştiren herkes talimatları yakından takip etmelidir.
Protokolümüz karmaşık olduğundan, her adımın karmaşık ayrıntılarını görselleştirmek, diğer araştırmacıların eksozom içermeyen FBS üretmelerine, istenen FBS hacmini ultracentrifuge etmelerine ve eksozom içermeyen süpernatantı toplamalarına yardımcı olacaktır. ESD üç hücresini kaplamadan önce, 15 santimetrelik doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0,1 Jelatin ile kaplayın. Aspirasyon ve kültür ile Jelatin çıkarın ESD'de besleyici katman hücresi olmayan ESD üç hücreli üç hücre, hücreler% 90 izdiah edene kadar% 5 Karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede orta.
Neredeyse bir aradaki kültürleri, yemek başına beş mililitre %0,05 trypsin ile yıkayın ve ardından taze tripsinlerde 37 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon. Kuluçkanın sonunda müstakil hücreleri bir santrifüj tüpüne çekin ve trypsin'i beş mililitre taze kültür ortamı ile etkisiz hale getirin. Hücreleri santrifüjleme ile tortulayın ve paletleri geçmek için saymak için taze ortamda yeniden askıya alın, plaka beş kez 10 ila altıncı ESD hücre kültürü 15 mililitre hücre kültürü orta yeni Jelatin kaplamalı plakalar üzerinde üç gün kültür alt kültleme önce hücre kültürü supernatant ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezne plakasının izolasyonu için toplamak için bir kez 10 kez yedinci ESD üç hücre 15 hücre kültürü mililitreleri yeni Jelatin kaplı plaka başına üç gün boyunca hücre kültürü süpernatantlarını toplamadan önce ekzozom zenginleştirilmiş ekstra hücresel veziklin izolasyonu için, İlk önce 72 saat kültürlenmiş ESD üç hücreden toplanan süpernatantlar içindeki büyük hücre parçalarını santrifüjleme ile yatıştırın.
Süpernatantı topladıktan sonra, Ultracentrifuge örnekleri ve süpernatantları atın. Üreticinin talimatına göre, herhangi bir kalıntı kültür üstnatanını çıkarmak ve ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikül protein içeriğini Bicinchoninic asit tahlili ile ölçmek için her paleti yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Daha sonra pbs'deki eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri eksi 80 santigrat derecede depolamak için mikro metre konsantrasyonu başına altı mikrogram olarak yeniden askıya alın.
Ekstrakom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri iletim elektron mikroskopisi ile görselleştirmek için, hücre dışı veziklin mililitre başına üç ila beş mikrogramı, oda sıcaklığında iki saat boyunca% 2 elektron mikroskop ızgara paraformaldehit son konsantrasyonu ile sabitlemek. Kuluçkanın sonunda, sabit numunelerin 10 mikrolitresini filtre kağıdı ile ızgaraları boşaltmadan önce bir dakika boyunca karbon destek filmi ile Bakır Izgaralara yükleyin, üreticinin protokolüne göre uygun bir boyama çözeltisi ile ızgaralarda kalın ve ızgaraları bir filtre kağıdı parçasına aktarmak için cımbız kullanın, daha sonra standart protokollere göre elektron mikroskopi görüntüleri elde etmek için iletim elektron mikroskobu 50.000 kat büyütme ile kullanın. Tüm Hücre Özlerini hazırlamak için, gösterildiği gibi kültürden ESD üç hücre toplayın ve PBS'de hasat edilen hücreleri sayım için yeniden askıya alın.
İkinci bir santrifüjlemeden sonra, %0,5 SDS konsantrasyonu içeren SDS sayfa yükleme tamponunun mikroliteri başına beş çarpı 10'dan üçüncü hücrelere kadar hücreleri yeniden askıya alın ve örnekleri %10 genlikli bir Sonicator'da 10 saniye boyunca sonicate edin. Daha sonra numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziküller için lizaz hazırlamak, Mikroliter konsantrasyonu başına 1,2 mikrogramda %0,5 SDS içeren SDS sayfa yükleme tamponunda eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezikülleri yeniden askıya alın ve numuneleri gösterildiği gibi 10 saniye boyunca sonicate edin, ardından numuneleri beş dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın.
Batı Blot Analizi için, 10 mikrolitre toptan ekstrakt ve ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklin lizat örneklerini en iyi stres sayfası jelinin bireysel Kuyularına yükleyin. Koşunun sonunda, proteinleri PVDF membranlarına aktarın ve membranları uygun birincil ve ikincil ilgi antikorlarıyla kuluçkaya yatırın, ardından üreticinin talimatlarına göre gelişmiş bir kemümilüminesans tespit kiti kullanarak protein ekspresyonunun tespit edilmesi. Exozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerde GM-CSF miktarını değerlendirmek, Bir ELISA Plakasını anti GM-CSF yakalama antikoru ile kaplamak için bir kit kullanın, 0,6 mikrogram ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklin örneğini sadece 100 mikrolitre PBS ile veya PBS artı 0,05% ara 20 oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin.
Kuluçkanın sonunda, tedavi edilen numuneleri oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için hazırlanan ELISA Plakasının bireysel Kuyularına ekleyin ve ardından uygun karşılık gelen Kuyuların sadece PBS ile yıkanması veya PBS artı% 0.05 ara 20. Yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için numunelere algılama antikorunu ekleyin ve ardından sadece PBS veya PBS ile yıkama artı gösterildiği gibi% 0.05 ara 20, Daha sonra oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için numunelere Avidin Yaban Turpu Peroksidaz ekleyin, ardından 450 nanometrede bir Mikro plaka Okuyucusunda her kuyudaki emiciliği yıkayın ve ölçün. ESD üç hücre hattını veya boş bir vektörü ifade eden bir ESD üç hücre hattını ifade eden bir GM-CSF'nin GFP floresan yoğunluğu, ebeveyn meslektaşlarından çok daha yüksektir.
ELISA, GM-CSF'yi ifade eden ESD üç hücresinin hücre kültüründe boş vektör kontrol hücrelerinden belirgin şekilde daha yüksek gmcsf seviyeleri ürettiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca, GM-CSF'nin ESD üç hücresini ifade ederek ürettiği GM-CSF miktarı, GM-CSF'yi ifade eden STO fibroblastları tarafından üretilene benzer. Vektör transdüklenmiş ve GM-CSF transdüklenmiş hücre kültürlerinden izole edilmiş hücre dışı veziküllerin iletim elektron mikroskopisi, beklenen 30 ila 100 nanometre çap aralığına giren farklı boyutlardaki vezikülleri ortaya koymaktadır.
CD81, Annexin V ve flotillin-1 dahil olmak üzere ekzomal belirteçlerin ekspresyözü, Batı blot analizi ile karşılık gelen toptan özlere kıyasla ESD üç hücresinden izole edilmiş hücre dışı veziklilerde belirgin bir şekilde geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, endoplazmik retikulum belirteci, Protein Disülfit Isomerase, mitokondriyal belirteçler, sitokrom C ve Oxphos kompleks IV-subunit IV ve sitozolik belirteç GAPDH dahil olmak üzere ESD türevli üç hücre dışı vezikülde diğer hücresel altı bölme belirteçlerinin varlığı saptanmamıştır. %0,05 ara 20 ile yıkandıktan sonra, hücre dışı veziklikleri kontrolde tespit edilen arka plan GM-CSF seviyeleri önemli ölçüde azaltıldı.
Buna karşılık, GM-CSF ekspresyatör hücrelerinin hücre dışı vezikliklerindeki GM-CSF seviyeleri 20 ara ile önemli ölçüde artmıştır. GMCSF taşıyan yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezneler elde etmek, bu protokolün başarısı için en önemli adımdır. Araştırmacılar, GM-CSF'ye bağımlı hücre hatlarındaki ve hayvanlardaki çalışmalar gibi ek deneyler gerçekleştirerek GM-CSF'ye bakan eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinlerin hücresiz bağışıklık düzenleyici veziküller olarak işlev görüp göremeyeceğini belirleyebilirler.
Bu eksozom zenginleştirilmiş hücre dışı vezneler daha sonra immün yanıtın modülasyonunun farklı hastalık koşullarını nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
