우리의 프로토콜은 면역 자극 인자, GM-CSF를 표현하는 배아 줄기 세포에서 고품질 엑소좀 농축 세포 소포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. GM-CSF를 운반하는 Exosome 농축 세포 외 소포는 면역 반응을 조절할 수 있는 세포 없는 면역 조절 소포를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 기본적인 분자 및 세포 생물학 훈련을 가진 연구원은, 이 프로토콜을 할 수 있는 것처럼 쉽게 할 수 있어야 합니다, 그러나 처음으로 이 프로토콜을 능력을 발휘하는 사람은 밀접하게 지시를 따라야 합니다.
우리의 프로토콜은 복잡하기 때문에 각 단계의 복잡한 세부 사항을 시각화하면 다른 연구자들이 외형 무료 FBS를 생성하고 FBS의 원하는 볼륨을 초원심 분리하고 엑소좀 무료 상신수를 수집하는 데 도움이 됩니다. ESD 3개의 세포를 도금하기 전에 실온에서 0.1%젤라틴으로 15센티미터 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅하십시오. 세포가 90%에 도달할 때까지 37°C에서 37°C에서 37°C에서 37°C에서 ESD 3세포 세포가 없는 ESD 3세포를 포부및 배양시킴으로써 젤라틴을 제거한다.
요리당 0.05%의 트립신 5밀리리터로 거의 혼잡한 문화를 씻어내고, 신선한 트립신에서 섭씨 37도에서 5분간 배양을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심 분리 기 튜브에 분리 된 세포를 당기고 신선한 배양 배지의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 세포 중퇴는 15밀리리터에서 ESD 3세포의 5배에서 6분의 1을 10으로 플레이트하여 15밀리리터의 새로운 젤라틴 코팅 플레이트에 10배씩 세포배양식을 수집하여 외성 농축 외세포의 분리를 위한 세포 배양 슈퍼탄트 10배를 수집하여 10배의 세포배양식에 대한 세포배양초극을 수집하여 10배의 세포배양소에 다시 중단한다. 새로운 젤라틴 코팅 판당 세포 배양 배지의 밀리리터는 세포 배양 체계를 수집하기 3일 전에 엑소좀 농축된 엑스트라 세포 소포 절연, 72시간 배양ESD 3세포로부터 수집된 초중질 내의 큰 세포 단편을 원심분리에 의한 것으로 한다.
상체를 수집한 후, 초원심분리는 샘플을 폐기하고 초월제를 폐기한다. 제조사의 지시에 따라 세척당 PBS 1밀리리터로 각 팔레트를 두 번 부드럽게 헹구어 잔류 배양 슈퍼네탄을 제거하고 비신천산 분석으로 외성 농축 세포 외 소포 단백질 함량을 정량화합니다. 그런 다음 영하 80도에서 저장하기 위해 마이크로 미터 농도당 6 마이크로 그램으로 PBS에서 외식 농축 세포 외 소포를 다시 중단합니다.
투과 전자 현미경에 의해 외형 농축 외세포 소포를 시각화하려면 2시간 동안 실온에서 2%의 전자 현미경 그리드 파라포름알데히드의 최종 농도로 세포외 소포의 밀리리터당 3~5마이크로그램을 수정한다. 인큐베이션의 끝에서, 필터 종이로 그리드를 배출하기 전에 1 분 동안 탄소 지원 필름구리 그리드에 고정 된 샘플의 10 마이크로 리터를로드, 적절한 염색 솔루션그리드에 머물고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 핀셋을 사용하여 필터 용지의 조각으로 그리드를 전송, 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 전자 현미경 이미지를 획득하기 위해 50 배율, 000 배율로 전송 전자 현미경을 사용합니다. 전세포 추출물을 준비하려면, 입증된 바와 같이 배양으로부터 ESD 3개의 세포를 수집하고, 계산을 위해 PBS에서 수확된 세포를 다시 중단한다.
두 번째 원심 분리 후, 0.5%SDS 농도를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼의 마이크로리터 당 5배 10에서 세 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 10%의 진폭을 가진 소닉레이터에서 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 가열합니다. 외형 농축 세포 소포에 대한 용액을 준비하기 위해, 마이크로 리터 농도 당 1.2 마이크로 그램에서 0.5 %SDS를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼에서 외성 농축 세포 외 소포를 다시 중단하고 시연 된 바와 같이 샘플을 10 초 동안 초음파 처리한 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5 분 동안 가열합니다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 10 마이크로 리터 도매 추출물과 엑소좀 농축 세포 외 소포 리세이트 샘플을 최고의 스트레스 페이지 젤의 개별 우물에 적재하십시오. 실행의 끝에서, PVDF 막에 단백질을 전송하고 관심의 적절한 기본 및 이차 항체와 막을 배양, 다음 향상된 화학 발광 검출 키트를 사용하여 단백질 발현을 감지, 제조 업체의 지침에 따르면. 엑소좀 농축 세포 외 소포 내에서 GM-CSF의 양을 평가하기 위해 키트 Murine GM-CSF를 사용하여 ELISA 플레이트를 안티 GM-CSF 포획 항체로 코팅하고, PBS 의 마이크로리터 100마이크로리터를 단독으로 처리하거나 PBS 플러스 0.05%tween 200분 실내에서 20분 동안 0.05%tween을 치료하십시오.
인큐베이션이 끝나면, 준비된 ELISA 플레이트의 개별 우물에 1시간 동안 실내 온도에서 배양한 다음 PBS단독으로 적절한 해당 웰을 세척하거나 PBS 플러스 0.05%tween 20을 첨가한다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS단독으로 세척한 다음 PBS와 0.05%tween 20을 첨가한 다음, 실온에서 30분 동안 시료에 아비딘 호스레디시어 페록시다제를 첨가한 다음, 40마이크로미터의 각 마이크로플레이트에서 각 마이크로플레이트에서 흡수를 측정한다. GFP 형광 강도는 ESD 3 세포주 또는 빈 벡터를 표현하는 ESD 3 세포주 또는 ESD 3 세포줄을 표현하는 GM-CSF의 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높습니다.
ELISA는 GM-CSF를 발현하는 ESD 3개의 세포가 빈 벡터 제어 세포보다 세포 배양 상류체에서 현저하게 더 높은 수준의 GMCSF를 생성한다는 것을 밝힙니다. 더욱이, GM-CSF가 ESD 3세포를 발현하는 GM-CSF에 의해 생성된 GM-CSF의 양은 GM-CSF를 발현하는 STO 섬유아세포에 의해 생성된 것과 유사하다. 벡터 트랜스듀시 및 GM-CSF 트랜스포이크 세포 배양으로부터 분리된 세포외 소포의 전송 전자 현미경 검사는 예상 된 30 ~ 100 나노미터 직경 범위 내에 속하는 다른 크기의 소포를 나타낸다.
CD81, 부속서 V 및 플로틸린-1을 포함한 외경 마커의 발현은 세포외 소포에서 현저하게 향상되며, 서구 블롯 분석에 의한 해당 도매 추출물에 비해 ESD 3세포로부터 분리된다. 중요한 것은, ESD에서 다른 세포체 구획 마커의 존재3 유래 세포 외 소포는 내시경 망상 마커, 단백질 이섬화증, 미토콘드리아 마커, 사이토크롬 C 및 옥스포스 복합 IV-서브유닛 IV 및 세포성 마커 GAPDH를 포함하였나. 0.05%tween 20으로 세척한 후, 대조군에서 검출된 배경 GM-CSF 수준이 크게 감소하였다.
대조적으로, GM-CSF 발현 세포의 세포외 소포에서 GM-CSF 수준은 트위닝에 의해 현저하게 증가하였다 20. GMCSF를 운반하는 고품질 엑소좀 농축 세포 외 소포를 획득하는 것은이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계입니다. 연구원은 GM-CSF 종속 세포주 및 동물에 있는 연구 결과와 같은 추가 실험을 능력을 발휘할 수 있습니다 GM-CSF를 돌보는 외민농축 세포 세포 소포가 세포 없는 면역 규제 소포로 작동할 수 있는지 여부를 결정합니다.
이러한 엑소좀 농축 세포 외 소포는 면역 반응의 변조가 다른 질병 조건에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.
