多細胞生物の中では、組織は空間配向でさらに高い度数を表示します。細胞は、形態形成の過程で大きな距離よりも優先順位の範囲を整列し、表示します。開発中に上皮の平面的な配置がどのように到達するかを理解するには、生体内で高い容量時間忠実度を持つ細胞の向きと成長ダイナミクスを追跡することが重要です。
記載されたプロトコルは、ショウジョウバエプパル表皮のグローバルおよび局所レベルで細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。この方法論は、研究、細胞生物学、形態形成、平面極性の異なる理論に関する洞察を提供し、他の組織、構造、およびモデルの分析に適用することができる。すべてのステップは、いくつかの練習の後に簡単に実行することができます。
彼らは精度を要求します。このプロトコルの可視化は、より短い時間で最適な結果を達成するのに役立ちます。パパル解離は複雑です。
まず、湿らせた絵筆を使用して、段階的な白いプレパエを新鮮なプラスチックバイアルに移し、必要な限り摂氏25度でそこに保管してください。次に、鉗子の助けを借りてバイアルの壁から各子犬を取り除きます。両面付き粘着テープで覆われたガラススライドに、各子犬の腹側を接着します。
頭の尖塔と子犬の後ろ面を鉗子の先端で静かにタップして、パパルケースのテープへの接着を保証します。鉗子で子犬からオペルキュラムを静かに取り除くことによって、ステレオ顕微鏡の下で解剖を開始します。口の開き口を通して、パパルケースと子犬の表面の間の浅い部分に鉗子の1つの先端を挿入する。
1つ以上のスイングで頭から尾までケースを引き裂き、子犬をつまむのを避けます。後端に進み続ける際に、ひび割れたプパルケースを側面に折り返します。慎重に動物の下に鉗子を挿入し、穏やかに引き上げて、開いたプパルケースから子犬を取り除きます。
子犬は鉗子の先端にくっつきます。腹側で子犬をそっと持ち、ガス透過性ハロカーボンオイルの小さな滴の上にガラス底の皿に子犬を移します。皿の端に濡れたティッシュペーパーを転がし、湿気を維持するために皿を覆う。
ドメインと評価されるプロセスに応じて、ガラス底の皿の油滴の上に子犬を向けます。長期のライブ撮像のために、後ろ座の巣の早期拡張のために、後方は、横方向の子犬。彼らの後期膨張および組織の改造をイメージするために、ふけり状に子犬を向ける。
取り付けられた子犬を含むガラス底皿を顕微鏡ステージに移し、透過光を使用して腹部の表面に焦点を合わせます。腹部上皮に遺伝的モザイクを誘導するために有糸組換えを採用するために、熱ショック誘導性フリパーゼを運ぶ処女女性、特定のゲノム位置のFRT部位、およびFRT部位に遠位する認識可能な細胞マーカーを調製する。FRT部位を同じゲノム位置に運ぶ変異体雄を準備する。
25°Cのプラスチックバイアルで3~1の割合で、いくつかの女性と男性を4〜5日間交差させます。体細胞のクローンをヒストラストで生成するには、動物を含むプラスチックバイアルを水浴中に45分~1時間水浴に浸すことによって、十字架の前立腺の第3のインスター幼虫段階で熱ショック処理を行う。イメージJソフトウェアでは、最大強度投影関数を使用して、2Dで共焦点顕微鏡で取得したZスタックスライスを保護します。
巣は、平面座標系の前から左に向き、最上部に後ろ向きに配置する特徴的な形状を持っています。この解析で最適な結果を得るには、入力画像を高解像度で取得する必要があります。ローカルセルのエッジで定性的な方向の値を取得するには、プラグインメニューをクリックし、方向 J 分布オプションを選択します。
ガウス窓のシグマを 1 ピクセルに、3 次スプラインを勾配に、最小コヘレンシーを 20% に設定し、最小エネルギーを 1% に設定します。プラグインのカラー調査オプションを使用します。色相を向き、彩度を一貫性に、明るさを入力画像に設定します。
この色は、設定された平面座標系に対するセルエッジの方向を符号化します。次に、プラグインメニューの配向 J メジャーオプションを使用して、セルラーの向きを数値化し、セル間の方向をセルに合わせます。ヒストブラストが占める領域内で20マイクロメートルの周りに20マイクロメートルの周りの均一な重量の関心の小さな、隣接しない非重なり領域を生成します。
押し付けメジャーは、ROI から優勢なローカル方向と一貫性を計算します。本研究では、使用される方法論は、著しい写真の漂白または光毒性なしに最大48時間の発達中の子犬の高解像度映画を生成することができる。ここでは、puparium形成後26時間にRFP NLSとその双子のスポットが存在しない場合に特徴付けられた野生型クローンの例を示す。
クローンは、セグメントの境界に沿って細長く表示されます。双クローンは並列または並行して配置される。26時間および47時間後の野生型クローンの形態は、両方の段階で複雑な境界形態を示す。
子犬の形成後26時間47時間の幾何学的パラメータの箱とひげ図は、この時間枠で有意に増加した平均面積と周囲を示しています。クローンのオリエンテーションは、拡張と改造の間に維持されました。26時間および47時間後の形成パラメータは、野生型クローンでほとんど変化しない粗さ、丸みおよび円形を示す。
子犬を損傷しないようにしてください、そうでなければ、それはライブイメージングに影響を与え、数時間以内に死ぬでしょう。このプロトコルは、サルタス試薬や器具を使用する必要はありません。解剖時に自分をつまむのは避けてください。
これらの方法論を応用することで、異なる想像技術を用いて長期間の高解像度ムービーを生成することが可能である。フォトンまたは回転するディスクへの焦点。ランダムセルはクロストークや細胞通信機構の同定を容易にするため、クロラル分析を用い、非自律応答を探索することができます。
これらの方法は、変態中の表皮、筋肉、および神経発達の調整を含む形態遺伝学的現象の全範囲を研究するために容易に適応することができる。
