The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

図3は、実験手順の概要を示しています。 1.組織調製<ol><li>目的の遺伝子の改変された表現の結果を判断するには、重複して、次のクロスを設定し、25℃で維持する：UAS-導入遺伝子 （オス）X GMR-GAL4。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b（処女雌）注：コントロール組織のクロスUAS-lacZをを得るためには、GMR-GAL4に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP女性 。 βガラクトシダーゼは、網膜内の細胞の挙動に欠陥を発生しない。 </li><li> RNAiの導入遺伝子の有効性を強化するために、クロスUAS-RNAiは、GMR-GAL4、UAS-DCR-2に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b処女雌。 注：異所性DCR-2を発現する網膜における細胞挙動の臨時欠陥が（データは示さない）が観察されている。警戒は、このアプローチを使用している場合をお勧めします。 </li><li> S1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の適切な遺伝子型と場所の白の前蛹を選出。蛹はDCR-2を発現する、男性または女性のどちらか蛹を選択した場合：UAS-DCR-2、X染色体上の挿入体の発現が、 ​​男性では強い。蛹は蛹のケースの色素沈着の前に0時間APFで性欲べきである - 男性の生殖腺は、蛹（後部から約3分の1）の側面に大きな透明地球儀として表示されます。 </li><li> 25℃で清潔なプラス​​チックチップ-BOXに、蛹を含むマイクロ遠心チューブをインキュベートします。先端-ボックスに、蒸留水に浸した組織の10cm 2のピース、蛹場所の乾燥を防ぐために。 注：チップインボックス内の湿度が高くなりすぎると蛹の場合は、後の工程で解剖することがねっとりと困難になることがある。 </li><li>適切な時間インキュベートする。目のパターニングに関連する細胞の挙動を取り込むには、約17時間のAPF、20時間のAPFまたは24時間のAPでイメージング用の蛹を準備F.は、特定の細胞の挙動を最もよく観測された場合にさらなる議論のための代表的な結果を参照してください。 </li><li>黒シルガードの解剖皿に新鮮な両面テープの一部を置きます。両面テープ（ 図1A）に付着した蛹の頭を持つ位置蛹、背側まで、.Try両面テープに蛹の胸部と腹部領域を接着するためではない。ピンセットで慎重に持ち上げて、蛹の頭部を露出させるために蓋を取り外します。片方の目の周りの領域を露出させるために蛹のケースの側面に沿って裂ける。 </li><li>静かに粘着テープから蛹を削除します。蛹が付着したままの場合は、接着力を弱めるために蛹のケースとテープの間の接合部に、少量の蒸留水を適用します。 </li></ol> 2.実装<ol><li>吸い取り紙から小さな15ミリメートル2フレームを構築し、middlethatで穴を開け、直径5.5ミリメートル（ 図1B）がある。蒸留水に浸し、中に配置します顕微鏡スライドの中心。 30ccのシリンジを使用して、吸い取り紙のフレームを取り囲むようにワセリンの均一なリングを絞り出す。ワセリンリングは蛹の幅よりもわずかに高く、リングの直径は、カバースリップの幅よりわずかに小さいことをことを確認してください。 </li><li>スライド上に直接ワセリンの小さなビーズを追加し、穴に.Carefully石油ゼリービーズ（ 図1D）でサポートされて、その側面に、さなぎを手配吸い取り紙（ 図1C）に打ち抜い。 </li><li>ワセリンリングの上にカバースリップを置きに接触眼の神経上皮（ 図1D）上記上皮ようにします。穏やかワセリンに対するカバースリップを密封し蛹目領域とカバーガラスとの間の小さな平坦な接触面を生成するための準備を圧縮する。 </li></ol> 3.蛍光イメージング<ol><li>画像使い蛹準備を蛍光顕微鏡。すべての7分接着結合の領域で、眼の神経上皮の頂端ドメインを介して連続切片をキャプチャします。 注：A）適切なシリアルのセクションでは、通常、0.2μmのZ-のステップで構成さzスタックあたり4-5である。 b）は、軽度の衝撃や折り目を含む上皮のトポロジーにおける不規則性、組織の大きな領域の焦点の合った画像を取得することが困難なことがあります。画像化しながら、一合焦であると関心領域の一部を見つけることが、隣接領域がピンボケすること。蛹の目とカバーガラスの間に蒸留水の小液滴を含めると、いくつかの急性組織襞ではなく、蛹の眼の形態形成の初期段階の穏やかに不均一なトポロジー特性を排除することができます。これらの例では合焦スライスフィールド全体について取得されるまで、zスタックを拡張することによって、組織をオーバーサンプリングする。 C）連続切片ごとに7分のキャプチャ重要なのReduずに3から4時間のライブイメージングを有効にする必要があります画像品質を損なう可能性GFPの蛍光強度のction。短い時間間隔で画像化の合計時間を減少させることができる。 </li><li> 3から4時間イメージングを続行します。蛹の成長と血リンパのポンプが網膜との位置を移動させるので、多くの蛍光顕微鏡で提供されていますオートフォーカスと時間関数を使用しないでください警戒再焦点ごとに14-21分を必要としている。 4時間を超えたことイメージングが遅くなったり、目の形態形成を停止することがあります。 </li><li>バックグラウンドを低減し、連続切片の画像のコントラストを向上させるために適切なデコンボリューションソフトウェアを使用する。各zスタックファイルの場合は、（材料の表を参照）LAS AFソフトウェアで次の手順を実行します。ツールパネルに移動し、3Dデコンボリューションを選択し、[適用]をクリックします。 </li><li>各デコンボリューションスタック·ファイルの最大投影（MP）イメージの生成：ツールパネルに移動し、3D投影]を選択し、[適用]をクリックします。 注：最大投影アルゴリズムは、均一の生成に失敗することがありますオーバーサンプリングされた組織のためのLY焦点画像。焦点外の領域を鮮鋭化するための技術は、ステップ5.2に概説されている。 </li></ol> 4.ポスト·イメージング蛹レスキューと表現型の検証<ol><li>アーティファクトが導入または蛹は、撮影時に傷つけられたかどうかを検討するために、慎重にイメージング·リグから蛹​​を削除します。使用して鉗子は、カバースリップを削除し、食品のきれいなバイアルに蛹を転送する。室温または25℃で保存大人のハエが出現するまで。 </li><li>慎重に大人の目の表現型を調べ、元のフライのクロスから出てくる大人のハエの目と比較する。 </li></ol> 5.画像処理<ol><li>自動画像調整： 注：ライブショウジョウバエ組織が ​​シフトし、画像化プロセスを通して成長します。したがって、画像の中心は、ショウジョウバエ組織内の同じポイントに対応しないことが連続した時間点で収集した。加えて全体網膜ディスクは、〜21と23時間APFとの間で約30°回転します。個々の細胞の挙動を強調表示して生物成長による注意散漫を低減し、これを手動で実行することができ、各MP image.While、ここで使用される画像編集ソフトウェアを整列するプロセスを促進することができ、組み込みのアルゴリズムた（ 材料の表を参照のこと）。 <ol><li>スタックにメインメニュー、オープンスクリプトおよびロード]を選択ファイルのファイルタブから。 </li><li>ロードレイヤーパネルにMPイメージファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。 注：このオプションを選択した場合、ソフトウェアは、画像データを歪めるアラインメントアルゴリズムを使用してもよい。 </li><li>すべてのMPファイルはレイヤーペインにロードされた後は、全ての画像が最も早い時点は、層スタックの一番上になるように、時系列順になっていることを確認してください。層が正しい順序になっていない場合、それらが順序付けされるまで、それらをドラッグアンドドロップ正しく。 </li><li>メインメニューの[編集]タブから自動整列レイヤーを選択します。再配置を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>自動位置合わせアルゴリズムは、関連する焦点にフレームを配向させるために失敗した場合は、移動ツールを使用してマイナーな調整を行う。 </li></ol></li><li>コンポジットシャープ： 注：初期MPイメージのピンボケの領域は「トリミング」LAS AFソフトウェアで対応するデコンボリューションスタックによって先鋭化することができます。スタックファイルをトリミングすると、1が手動で最大投影アルゴリズムに供されるzスタックの間隔を制限することができます。 <ol><li> （[プロセス]タブの下）ツールパネルのクロップ機能を探します。手動で彼らが最初に焦点外の領域内にのみ接着ベルトにまたがるように最初と最後のスライスを制限する。この地域のために最適化された新しいスタックファイルを生成するために、[適用]をクリックします。 </li><li> TIFFファイルとしてローカルに最適化されたスタックと輸出のための新しい最大投影を生成します。 </li><li>目で電子画像編集ソフトウェア（材料の表を参照）、スタックに（メインメニューの[ファイル]タブにあります）を開いているスクリプトとロード]を選択ファイル。 </li><li>ロードレイヤーパネルに特定の時点の初期MPイメージファイルと、ローカルに最適化されたMPファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。 </li><li>ペイン層内の両方の層を選択して、均一に網膜のフィールドを、合焦得自動的に二つの画像の適切な領域をマスクする（メインメニューの[編集]タブにあります）オートブレンドレイヤーを選択します。 TIFFファイルとしてこの合成画像を保存します。 </li><li>繰り返しますが、すべての次善のMP画像について5.2.5を通じて5.2.1繰り返します。 </li></ol></li><li>さらに調整：回転、トリミング、ムービーレイヤーのレベルを調整します。 <ol><li>すべてのレイヤー選択した状態で、網膜の背腹軸が揃うように、画像を回転させるように変形ツール（編集&gt;自由変形）を使用しますムービーフレームのy軸に。 </li><li>必要であれば、所望のサイズおよび形状に視野を減らすために切り抜きツールを使用。 </li><li>細胞膜と細胞体の間のコントラストを強化するために（個々のフレームの）レベル調整を使用してください。 </li><li>文体の目的のために、各フレームにおける関心の点を強調するために偽色を紹介し、特定の細胞の挙動を強調する。 </li></ol></li><li>アニメーション：映画に画像を変換する： <ol><li>メインメニューの、Windowsのタブからアニメーションのペインを開きます。アニメーション枠の右上隅にあるメニューからレイヤーからフレームを作成]を選択。 </li><li>層は、スタックの底から始まる順番にアニメーション枠に追加されることに注意してください。フレームの順序を逆にするには、最初のフレームをすべて選択して、アニメーション枠メニューからリバースフレームを選択。 </li><li>フレーム親指の下にドロップダウンメニューを使用して、各フレームのフレーム遅延時間を選択ネイル。 注：本稿の4映画1フレーム遅延は0.8秒である。 </li><li>メインメニュー、オープン輸出の[ファイル]タブからとビデオをレンダリングを選択します。ファイルオプションの下QuickTime書き出しを選択し、目的のビデオ形式を選択します。カスタムフレームレート設定レンダリングオプション]で、15のフレームレートを入力して、レンダリングをクリックします。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. 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Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

野生型開発（上記）の説明は、RNAiパターニングイベントまたは過剰発現遺伝子型の比較のための基礎を形成する。正確に決定する際に生きている組織の発達の比較は、細胞の挙動、目的のタンパク質によって調節される非常に貴重である。さらに、ここでは説明しない、生細胞イメージングは​​1つが、そのパターンの目のイベントに関心のある遺伝子の役割の定性的および/または定量的?...

化合物ショウジョウバエの眼は、アクセサリ色素細胞4,5のハニカム格子で区切り、その〜750個眼のステレオタイプの配置によって特徴づけられる。ローカル細胞運動、細胞増殖、細胞形状の変化、及びアポ​​トーシスこれらの色素細胞は、イベントの協調組み合わせによってパターニングされる。この上皮のライブ可視化は1つが生理学的に関連し、非摂動3次元コンテキストでこれらのイベントを支える分子機構を研究することができます。 以前のプロトコル6,7とは対照的に、ここで説明する技術は、イメージングプロセスから分離することができない無関係な組織の動きを安定化するための効率的な方法を組み込んでいる。 、成長回転し、画像化の過程でシフト組織-このメソッドは、開発ショウジョウバエの蛹のアイ上皮における細胞の挙動の研究を強化する。加えて、動き安定化技術デここにスクライブ余分な動きが発生した他のコンテキストで細胞を研究するために有用であろう。 アイ固有のドライバGMR-GAL4 1-3の制御下にGFP：GFPなどUAS-αカテニン：シ ​​ョウジョウバエ網膜のフィールドにセル境界を視覚化するために、トランスジェニックハエラインはUBI-DEカドヘリン発現する生成した。 2 GFPタグ付きの膜マーカーの使用は、より低い強度の光でセル境界の視覚化を可能にする。これは、組織の損傷を最小限に抑え、高エネルギー波長に繰り返し暴露に退色増加フレームレート、動画継続を可能にする。 RNAiの導入遺伝子の有効性を高めるために、UAS-DCR-2は、第2フライライン8に組み込まれた。 以前のプロトコルから第三の更新では、簡単にほとんどの実験室で組み立てられた単純なイメージングリグについて説明する。この装置は、特殊なイメージングrを持つ必要性をなくす大学の「機械工場 &#39;または類似のサービスによって生成されたIG。この結像リグ画像他蛹組織9,10に用いられるものと同様である。 ここで提示直接蛹殻形成（時間APF）後〜17から42時間の眼のパターニングに寄与形態形成事象を評価するために使用できる単純な生細胞イメージングプロトコルである。具体的には、このプロトコルは、蛹の開発中に遺伝子発現を改変する結果を決定するために、1つを可能にする。

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard dissection dish</td><td></td><td></td><td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glass coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Or purchase at local pharmacy.</td></tr><tr><td>30 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

ショウジョウバエの蛹の開発の固有のプロセスがシフトし、生細胞イメージングの間に追跡する個々の細胞の挙動を困難にする方法で、眼の上皮を歪めることができます。これらのプロセスとしては、網膜回転、細胞増殖と生物の動きを。蛹は、それが困難な単一の焦点面で数個眼以上の焦点の合った画像を取得するために行う、画像化のために準備されるように加え、微妙なバンプとを含む上皮のトポロジにおける不規則性はしばしば導入襞。ワークフローは、ここにショウジョウバエの蛹の眼の開発中に細胞プロセスの容易な分析を可能に救済こ ​​れらの問題を、説明した。適切ステージ蛹を簡単にほとんどの研究室で組み立てることができる撮像リグに配置されているユビキチンDEカドヘリン：GFPとGMR-GAL4駆動型UAS-αカテニン：GFPを眼の上皮1のセル境界を視覚化するために使用されている-3。デコンボリューションは、された後複数の焦点面において捕捉蛍光画像に適用し、最大値投影画像は、各時点で生成され、画像編集ソフトウェアを使用して強化される。アラインメントアルゴリズムを迅速に追跡するために、個々の細胞の挙動が容易になり、余分な動きを安定化させるために使用される。

蛹の目のライブイメージングは​​、神経上皮のパターニングに貢献する細胞の挙動を観察する成功した戦略である。特定のタンパク質の役割は、容易に眼の開発中のタンパク質レベルを変更する導入遺伝子を発現することによって評価することができる。このGMR-GAL4を行うために形態形成溝の背後に導入遺伝子発現を駆動するために使用される。これは最初の2幼虫齢の間、目のフィ?...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.4K ビュー.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

ビデオ: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

神経科学

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

発生生物学

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

生物学

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

<meta charset="utf8"></head><body>蛹を伴わない ショウジョウバエ の蛹脚形態形成の拡張ライブイメージング

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト: ショウジョウバエ の発生における動的上皮構造の解明

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

のライブイメージング

要約

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

長期のライブイメージング

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

のライブイメージング

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

のライブイメージング

要約

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

長期のライブイメージング

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

のライブイメージング

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

蛹摘出後のショウジョウバエの蛹の脚の発達の長期ライブイメージング