The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

図3は、実験手順の概要を示しています。 1.組織調製<ol><li>目的の遺伝子の改変された表現の結果を判断するには、重複して、次のクロスを設定し、25℃で維持する：UAS-導入遺伝子 （オス）X GMR-GAL4。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b（処女雌）注：コントロール組織のクロスUAS-lacZをを得るためには、GMR-GAL4に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP女性 。 βガラクトシダーゼは、網膜内の細胞の挙動に欠陥を発生しない。 </li><li> RNAiの導入遺伝子の有効性を強化するために、クロスUAS-RNAiは、GMR-GAL4、UAS-DCR-2に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b処女雌。 注：異所性DCR-2を発現する網膜における細胞挙動の臨時欠陥が（データは示さない）が観察されている。警戒は、このアプローチを使用している場合をお勧めします。 </li><li> S1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の適切な遺伝子型と場所の白の前蛹を選出。蛹はDCR-2を発現する、男性または女性のどちらか蛹を選択した場合：UAS-DCR-2、X染色体上の挿入体の発現が、 ​​男性では強い。蛹は蛹のケースの色素沈着の前に0時間APFで性欲べきである - 男性の生殖腺は、蛹（後部から約3分の1）の側面に大きな透明地球儀として表示されます。 </li><li> 25℃で清潔なプラス​​チックチップ-BOXに、蛹を含むマイクロ遠心チューブをインキュベートします。先端-ボックスに、蒸留水に浸した組織の10cm 2のピース、蛹場所の乾燥を防ぐために。 注：チップインボックス内の湿度が高くなりすぎると蛹の場合は、後の工程で解剖することがねっとりと困難になることがある。 </li><li>適切な時間インキュベートする。目のパターニングに関連する細胞の挙動を取り込むには、約17時間のAPF、20時間のAPFまたは24時間のAPでイメージング用の蛹を準備F.は、特定の細胞の挙動を最もよく観測された場合にさらなる議論のための代表的な結果を参照してください。 </li><li>黒シルガードの解剖皿に新鮮な両面テープの一部を置きます。両面テープ（ 図1A）に付着した蛹の頭を持つ位置蛹、背側まで、.Try両面テープに蛹の胸部と腹部領域を接着するためではない。ピンセットで慎重に持ち上げて、蛹の頭部を露出させるために蓋を取り外します。片方の目の周りの領域を露出させるために蛹のケースの側面に沿って裂ける。 </li><li>静かに粘着テープから蛹を削除します。蛹が付着したままの場合は、接着力を弱めるために蛹のケースとテープの間の接合部に、少量の蒸留水を適用します。 </li></ol> 2.実装<ol><li>吸い取り紙から小さな15ミリメートル2フレームを構築し、middlethatで穴を開け、直径5.5ミリメートル（ 図1B）がある。蒸留水に浸し、中に配置します顕微鏡スライドの中心。 30ccのシリンジを使用して、吸い取り紙のフレームを取り囲むようにワセリンの均一なリングを絞り出す。ワセリンリングは蛹の幅よりもわずかに高く、リングの直径は、カバースリップの幅よりわずかに小さいことをことを確認してください。 </li><li>スライド上に直接ワセリンの小さなビーズを追加し、穴に.Carefully石油ゼリービーズ（ 図1D）でサポートされて、その側面に、さなぎを手配吸い取り紙（ 図1C）に打ち抜い。 </li><li>ワセリンリングの上にカバースリップを置きに接触眼の神経上皮（ 図1D）上記上皮ようにします。穏やかワセリンに対するカバースリップを密封し蛹目領域とカバーガラスとの間の小さな平坦な接触面を生成するための準備を圧縮する。 </li></ol> 3.蛍光イメージング<ol><li>画像使い蛹準備を蛍光顕微鏡。すべての7分接着結合の領域で、眼の神経上皮の頂端ドメインを介して連続切片をキャプチャします。 注：A）適切なシリアルのセクションでは、通常、0.2μmのZ-のステップで構成さzスタックあたり4-5である。 b）は、軽度の衝撃や折り目を含む上皮のトポロジーにおける不規則性、組織の大きな領域の焦点の合った画像を取得することが困難なことがあります。画像化しながら、一合焦であると関心領域の一部を見つけることが、隣接領域がピンボケすること。蛹の目とカバーガラスの間に蒸留水の小液滴を含めると、いくつかの急性組織襞ではなく、蛹の眼の形態形成の初期段階の穏やかに不均一なトポロジー特性を排除することができます。これらの例では合焦スライスフィールド全体について取得されるまで、zスタックを拡張することによって、組織をオーバーサンプリングする。 C）連続切片ごとに7分のキャプチャ重要なのReduずに3から4時間のライブイメージングを有効にする必要があります画像品質を損なう可能性GFPの蛍光強度のction。短い時間間隔で画像化の合計時間を減少させることができる。 </li><li> 3から4時間イメージングを続行します。蛹の成長と血リンパのポンプが網膜との位置を移動させるので、多くの蛍光顕微鏡で提供されていますオートフォーカスと時間関数を使用しないでください警戒再焦点ごとに14-21分を必要としている。 4時間を超えたことイメージングが遅くなったり、目の形態形成を停止することがあります。 </li><li>バックグラウンドを低減し、連続切片の画像のコントラストを向上させるために適切なデコンボリューションソフトウェアを使用する。各zスタックファイルの場合は、（材料の表を参照）LAS AFソフトウェアで次の手順を実行します。ツールパネルに移動し、3Dデコンボリューションを選択し、[適用]をクリックします。 </li><li>各デコンボリューションスタック·ファイルの最大投影（MP）イメージの生成：ツールパネルに移動し、3D投影]を選択し、[適用]をクリックします。 注：最大投影アルゴリズムは、均一の生成に失敗することがありますオーバーサンプリングされた組織のためのLY焦点画像。焦点外の領域を鮮鋭化するための技術は、ステップ5.2に概説されている。 </li></ol> 4.ポスト·イメージング蛹レスキューと表現型の検証<ol><li>アーティファクトが導入または蛹は、撮影時に傷つけられたかどうかを検討するために、慎重にイメージング·リグから蛹​​を削除します。使用して鉗子は、カバースリップを削除し、食品のきれいなバイアルに蛹を転送する。室温または25℃で保存大人のハエが出現するまで。 </li><li>慎重に大人の目の表現型を調べ、元のフライのクロスから出てくる大人のハエの目と比較する。 </li></ol> 5.画像処理<ol><li>自動画像調整： 注：ライブショウジョウバエ組織が ​​シフトし、画像化プロセスを通して成長します。したがって、画像の中心は、ショウジョウバエ組織内の同じポイントに対応しないことが連続した時間点で収集した。加えて全体網膜ディスクは、〜21と23時間APFとの間で約30°回転します。個々の細胞の挙動を強調表示して生物成長による注意散漫を低減し、これを手動で実行することができ、各MP image.While、ここで使用される画像編集ソフトウェアを整列するプロセスを促進することができ、組み込みのアルゴリズムた（ 材料の表を参照のこと）。 <ol><li>スタックにメインメニュー、オープンスクリプトおよびロード]を選択ファイルのファイルタブから。 </li><li>ロードレイヤーパネルにMPイメージファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。 注：このオプションを選択した場合、ソフトウェアは、画像データを歪めるアラインメントアルゴリズムを使用してもよい。 </li><li>すべてのMPファイルはレイヤーペインにロードされた後は、全ての画像が最も早い時点は、層スタックの一番上になるように、時系列順になっていることを確認してください。層が正しい順序になっていない場合、それらが順序付けされるまで、それらをドラッグアンドドロップ正しく。 </li><li>メインメニューの[編集]タブから自動整列レイヤーを選択します。再配置を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>自動位置合わせアルゴリズムは、関連する焦点にフレームを配向させるために失敗した場合は、移動ツールを使用してマイナーな調整を行う。 </li></ol></li><li>コンポジットシャープ： 注：初期MPイメージのピンボケの領域は「トリミング」LAS AFソフトウェアで対応するデコンボリューションスタックによって先鋭化することができます。スタックファイルをトリミングすると、1が手動で最大投影アルゴリズムに供されるzスタックの間隔を制限することができます。 <ol><li> （[プロセス]タブの下）ツールパネルのクロップ機能を探します。手動で彼らが最初に焦点外の領域内にのみ接着ベルトにまたがるように最初と最後のスライスを制限する。この地域のために最適化された新しいスタックファイルを生成するために、[適用]をクリックします。 </li><li> TIFFファイルとしてローカルに最適化されたスタックと輸出のための新しい最大投影を生成します。 </li><li>目で電子画像編集ソフトウェア（材料の表を参照）、スタックに（メインメニューの[ファイル]タブにあります）を開いているスクリプトとロード]を選択ファイル。 </li><li>ロードレイヤーパネルに特定の時点の初期MPイメージファイルと、ローカルに最適化されたMPファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。 </li><li>ペイン層内の両方の層を選択して、均一に網膜のフィールドを、合焦得自動的に二つの画像の適切な領域をマスクする（メインメニューの[編集]タブにあります）オートブレンドレイヤーを選択します。 TIFFファイルとしてこの合成画像を保存します。 </li><li>繰り返しますが、すべての次善のMP画像について5.2.5を通じて5.2.1繰り返します。 </li></ol></li><li>さらに調整：回転、トリミング、ムービーレイヤーのレベルを調整します。 <ol><li>すべてのレイヤー選択した状態で、網膜の背腹軸が揃うように、画像を回転させるように変形ツール（編集&gt;自由変形）を使用しますムービーフレームのy軸に。 </li><li>必要であれば、所望のサイズおよび形状に視野を減らすために切り抜きツールを使用。 </li><li>細胞膜と細胞体の間のコントラストを強化するために（個々のフレームの）レベル調整を使用してください。 </li><li>文体の目的のために、各フレームにおける関心の点を強調するために偽色を紹介し、特定の細胞の挙動を強調する。 </li></ol></li><li>アニメーション：映画に画像を変換する： <ol><li>メインメニューの、Windowsのタブからアニメーションのペインを開きます。アニメーション枠の右上隅にあるメニューからレイヤーからフレームを作成]を選択。 </li><li>層は、スタックの底から始まる順番にアニメーション枠に追加されることに注意してください。フレームの順序を逆にするには、最初のフレームをすべて選択して、アニメーション枠メニューからリバースフレームを選択。 </li><li>フレーム親指の下にドロップダウンメニューを使用して、各フレームのフレーム遅延時間を選択ネイル。 注：本稿の4映画1フレーム遅延は0.8秒である。 </li><li>メインメニュー、オープン輸出の[ファイル]タブからとビデオをレンダリングを選択します。ファイルオプションの下QuickTime書き出しを選択し、目的のビデオ形式を選択します。カスタムフレームレート設定レンダリングオプション]で、15のフレームレートを入力して、レンダリングをクリックします。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

野生型開発（上記）の説明は、RNAiパターニングイベントまたは過剰発現遺伝子型の比較のための基礎を形成する。正確に決定する際に生きている組織の発達の比較は、細胞の挙動、目的のタンパク質によって調節される非常に貴重である。さらに、ここでは説明しない、生細胞イメージングは​​1つが、そのパターンの目のイベントに関心のある遺伝子の役割の定性的および/または定量的?...

化合物ショウジョウバエの眼は、アクセサリ色素細胞4,5のハニカム格子で区切り、その〜750個眼のステレオタイプの配置によって特徴づけられる。ローカル細胞運動、細胞増殖、細胞形状の変化、及びアポ​​トーシスこれらの色素細胞は、イベントの協調組み合わせによってパターニングされる。この上皮のライブ可視化は1つが生理学的に関連し、非摂動3次元コンテキストでこれらのイベントを支える分子機構を研究することができます。 以前のプロトコル6,7とは対照的に、ここで説明する技術は、イメージングプロセスから分離することができない無関係な組織の動きを安定化するための効率的な方法を組み込んでいる。 、成長回転し、画像化の過程でシフト組織-このメソッドは、開発ショウジョウバエの蛹のアイ上皮における細胞の挙動の研究を強化する。加えて、動き安定化技術デここにスクライブ余分な動きが発生した他のコンテキストで細胞を研究するために有用であろう。 アイ固有のドライバGMR-GAL4 1-3の制御下にGFP：GFPなどUAS-αカテニン：シ ​​ョウジョウバエ網膜のフィールドにセル境界を視覚化するために、トランスジェニックハエラインはUBI-DEカドヘリン発現する生成した。 2 GFPタグ付きの膜マーカーの使用は、より低い強度の光でセル境界の視覚化を可能にする。これは、組織の損傷を最小限に抑え、高エネルギー波長に繰り返し暴露に退色増加フレームレート、動画継続を可能にする。 RNAiの導入遺伝子の有効性を高めるために、UAS-DCR-2は、第2フライライン8に組み込まれた。 以前のプロトコルから第三の更新では、簡単にほとんどの実験室で組み立てられた単純なイメージングリグについて説明する。この装置は、特殊なイメージングrを持つ必要性をなくす大学の「機械工場 &#39;または類似のサービスによって生成されたIG。この結像リグ画像他蛹組織9,10に用いられるものと同様である。 ここで提示直接蛹殻形成（時間APF）後〜17から42時間の眼のパターニングに寄与形態形成事象を評価するために使用できる単純な生細胞イメージングプロトコルである。具体的には、このプロトコルは、蛹の開発中に遺伝子発現を改変する結果を決定するために、1つを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

ショウジョウバエの蛹の開発の固有のプロセスがシフトし、生細胞イメージングの間に追跡する個々の細胞の挙動を困難にする方法で、眼の上皮を歪めることができます。これらのプロセスとしては、網膜回転、細胞増殖と生物の動きを。蛹は、それが困難な単一の焦点面で数個眼以上の焦点の合った画像を取得するために行う、画像化のために準備されるように加え、微妙なバンプとを含む上皮のトポロジにおける不規則性はしばしば導入襞。ワークフローは、ここにショウジョウバエの蛹の眼の開発中に細胞プロセスの容易な分析を可能に救済こ ​​れらの問題を、説明した。適切ステージ蛹を簡単にほとんどの研究室で組み立てることができる撮像リグに配置されているユビキチンDEカドヘリン：GFPとGMR-GAL4駆動型UAS-αカテニン：GFPを眼の上皮1のセル境界を視覚化するために使用されている-3。デコンボリューションは、された後複数の焦点面において捕捉蛍光画像に適用し、最大値投影画像は、各時点で生成され、画像編集ソフトウェアを使用して強化される。アラインメントアルゴリズムを迅速に追跡するために、個々の細胞の挙動が容易になり、余分な動きを安定化させるために使用される。

蛹の目のライブイメージングは​​、神経上皮のパターニングに貢献する細胞の挙動を観察する成功した戦略である。特定のタンパク質の役割は、容易に眼の開発中のタンパク質レベルを変更する導入遺伝子を発現することによって評価することができる。このGMR-GAL4を行うために形態形成溝の背後に導入遺伝子発現を駆動するために使用される。これは最初の2幼虫齢の間、目のフィ?...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K ビュー.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

ビデオ: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

発生生物学

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...