Dentro de organismos multicelulares, o tecido exibe altos graus em sua orientação espacial. As células se alinham e exibem uma gama de prioridades em grandes distâncias ao longo da morfogênese. Para entender como os arranjos planares da epitélio são alcançados durante o desenvolvimento, é crucial acompanhar as orientações e dinâmicas de crescimento das células com alta fidelidade temporal espacial in vivo.
O protocolo descrito foi projetado para imagem e análise de comportamentos celulares em níveis globais e locais na epiderme pupal drosophila. Essa metodologia poderia fornecer insights sobre diferentes teorias da pesquisa, biologia celular, morfogênese e polaridade planar e pode ser aplicada à análise de outros tecidos, estruturas e modelos. Todas as etapas podem ser executadas facilmente após alguma prática.
Eles exigem precisão. A visualização deste protocolo ajuda a alcançar resultados ótimos em um tempo menor. A dissecção pupal é complexa.
Para começar, use um pincel umedecido para transferir pré-pupas brancas encenadas para um frasco de plástico fresco, e mantê-los lá pelo tempo necessário a 25 graus Celsius. Em seguida, remova cada pupae da parede do frasco com a ajuda de fórceps. Cole o lado ventral de cada pupa em um slide de vidro coberto com fita adesiva dupla face.
Bata suavemente nos espirros da cabeça e na superfície dorsal da pupa com as pontas dos fórceps para garantir a adesão da caixa pupal à fita. Comece a dissecção sob um microscópio estéreo removendo suavemente o operculum do pupário com as fórceps. Insira uma ponta das fórceps em um raso entre a caixa pupal e a superfície da pupa através da abertura opercular.
Rasgue a caixa da cabeça à cauda lateralmente em um ou mais balanços, evitando beliscar a pupa. Dobre a caixa de pupal rachada para os lados laterais enquanto você continua procedendo para a extremidade posterior. Remova a pupa da caixa pupal aberta inserindo cuidadosamente os fórceps sob o animal e puxando suavemente para cima.
A pupa gruda na ponta dos fórceps. Segure a pupa suavemente pelo lado ventral, e transfira a pupa para um prato com fundo de vidro em cima de uma pequena gota de óleo de halocarboneto permeável a gás. Enrole um pedaço de papel de tecido molhado nas bordas do prato e cubra o prato para manter a umidade.
Oriente a pupa sobre a gota de óleo sobre os pratos com fundo de vidro de acordo com o domínio e o processo a ser avaliado. Para imagens vivas de longo prazo da expansão precoce dos ninhos dorsais, dorsais orientam lateralmente a pupa. Para imaginar sua expansão tardia e remodelação tecidual, orienta dormente a pupa.
Transfira o prato com fundo de vidro contendo a pupae montada para o estágio do microscópio e concentre-se na superfície da área abdominal usando luz transmitida. Para empregar recombinação mitótica para induzir mosaicos genéticos no epitélio abdominal, prepare fêmeas virgens carregando um flipase indutível de choque térmico, um local FRT em um local genômico específico, e um marcador celular reconhecível distal para o local da FRT. Prepare machos mutantes carregando um local FRT no local genômico equivalente.
Cruze várias fêmeas e machos em uma proporção de três a um em um frasco de plástico a 25 graus Celsius por quatro a cinco dias. Para gerar clones somáticos nos histoblastos, realize o tratamento de choque térmico no terceiro estágio larval instar da prole da cruz submergindo os frascos de plástico contendo os animais em um banho de água a 37 graus Celsius por 45 minutos a uma hora. No software imagem J, use a função de projeção de intensidade máxima para proteger as fatias de pilha Z adquiridas pela microscopia confocal em 2D.
Os ninhos têm uma forma característica que os orienta em um sistema de coordenadas planar anterior à esquerda e dorsal até o topo. Para alcançar resultados ótimos com esta análise, a imagem de entrada deve ser adquirida com alta resolução. Para obter valores de orientação qualitativa nas bordas de células locais, clique no menu plug-in e escolha a opção de distribuição J de orientação.
Defina o sigma da janela gaussiana para um pixel, spline cúbico para gradiente, coerência mínima para 20% e energia mínima para um por cento. Empregue a opção de pesquisa de cores do plug-in. Defina a tonalidade para orientação, saturação à coerência e brilho para a imagem de entrada.
Esta cor codifica as orientações de borda do celular em relação ao sistema de coordenadas do planar definido. Em seguida, sob o menu plug-in, use a opção de medida J orientação para quantificar orientações celulares e célula direcional para alinhamento celular. Gerar regiões pequenas e adjacentes não sobrepostas de interesse de peso uniforme em torno de 20 micrômetros vezes 20 micrômetros dentro da área ocupada pelos histoblastos.
A medida premente calcula a orientação e coerência local dominantes dos ROIs. Neste estudo, a metodologia utilizada é capaz de gerar filmes de alta resolução da pupae em desenvolvimento por períodos de até 48 horas sem branqueamento fotográfico significativo ou toxicidade fotográfica. Exemplos de clones do tipo selvagem marcados pela ausência de RFP NLS e seus pontos gêmeos às 26 horas após a formação do puparium são mostrados aqui.
Os clones alongaram-se ao longo dos limites segmentais. Clones gêmeos dispostos em paralelo ou em conjunto. A morfologia de um clone do tipo selvagem às 26 horas e 47 horas após a formação do puparium mostra morfologia de borda complexa em ambos os estágios.
Parcelas de caixa e bigode para parâmetros geométricos em 26 horas e 47 horas após a formação do puparium mostram que a área média e o perímetro aumentaram significativamente nesta janela de tempo. A orientação do clone foi mantida durante a expansão e remodelação. Parâmetros de forma em 26 horas e 47 horas após a formação do puparium indicam a rugosidade, a arredondamento e a circularidade mal alteradas nos clones do tipo selvagem.
Certifique-se de não danificar a pupa, caso contrário ela morrerá dentro de algumas horas, afetando imagens ao vivo. Este protocolo não requer um reagente de sartus ou instrumento para ser empregado. Evite se beliscar ao dissecar.
Aplicando essas metodologias possíveis para gerar filmes de alta resolução por longo prazo usando diferentes técnicas de imaginar. Focal para fótons ou discos giratórios. A análise de cloro pode ser empregada para explorar respostas não autônomas, uma vez que as células aleatórias facilitam na identificação de conversas cruzadas ou mecanismos de comunicação celular.
Esses métodos podem ser facilmente adaptados para estudar uma gama completa de fenômenos morfogenéticos, incluindo a coordenação do desenvolvimento epidérmico, muscular e neuro durante a metamorfose.
