この内皮細胞培養システムを用いることが血流の状況の同化を可能にする。そして、この状況では、細菌ベクターの同定や、このプロセスに関与する細胞ベクターの同定を含む細菌感染プロセスも分析することができます。この技術は、細菌感染が血管の完全性に及ぼす影響を探求する道を開きます, また、形態形成メカニズムへの影響を含みます, 炎症応答と免疫調節に.
この技術は、内皮細胞のいくつかの特別な取り扱いを必要とするため、視覚的な説明は単なる口頭での説明よりも優れています。この方法は、内皮細胞分化、創傷治癒、腫瘍発生および血管新生などの浸透血管系と相関する研究の他のいくつかの分野に関する洞察を提供する。重要なステップの1つは、標準化された細胞培養と、一次内皮細胞の正確な取り扱いです。
この技術は、口頭で説明するだけでは明らかではなかった特別な細胞培養処理を必要とする。まず、クリーンベンチを使用して無菌環境で作業します。ピペットを使用して、2%無菌濾過ブタゼラチンPBS溶液の100マイクロリットルを温度平衡チャネルスライドの単一の貯水池に注入します。
薄いポリスチレンまたは発泡スチロールプレートの上にゼラチンコーティングされたチャネルスライドを置き、1ミリリットルのルアーシリンジでスライド温度が低下するのを防ぎ、1ミリリットルのHUVEC懸濁液あたり10倍から5分の1の100マイクロリットルをスライドに加えて種子を播種し、HUVECを栽培します。HUVECでチャネルスライドを摂氏37度と5%の二酸化炭素で60分間インキュベートします。その後、チャネルスライドの両端にある各培地貯留層を60マイクロリットルのECGMS培地で満たします。
摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに1時間インキュベートする。次に、マイクロ流体ポンプを調整し、まず平衡した灌流をポンプユニットに接続し、13.6ミリリットルのECGMS培地を充填してポンプ制御ソフトウェアを開始する。流体ユニット設定のメニューで、スクロールダウンウィンドウを使用して、チャンバースライドの適切な灌流セットとタイプを選択します。
中粘度のソフトウェアで平方センチメートルあたり0.007ダイン秒を選択してください。インキュベーターの外側で、乾燥シリカビーズを充填したガラス瓶を空気圧チューブに接続します。ソフトウェアメニューでフローパラメータを選択し、圧力を40ミリバールに設定し、連続した媒体フローを開始して液体媒体でポンプチューブをフラッシュします。
私たちは、亜コンフルエントに成長したHUVECを使用してタイトな細胞の取り付けを確保し、さらにシステムから気泡を取り出すだけでなく、ポンプシステムのための独立した電源を使用することに焦点を当てます。チューブ接続をタップして気泡を取り除き、ポンプシステムで気泡が循環しないようにします。チャネルスライドを接続するには、ポンプ制御ソフトウェアの流れの循環を停止し、Luer接続の近くにチューブをクランプすることによって、媒体の流れと灌流管を保持します。
チャネルスライドを接続して、気泡を避けます。ポンプ制御ソフトウェアの高度なタブで、ソフトウェアツールサイクルクリエーターを使用して、フロー栽培に必要なせん断応力サイクルをプログラムします。流れの循環のためのせん断応力レベルをプログラムし、長期灌流を開始する。
1平方センチメートル当たり5ダイン/平方センチメートルで始まり、毎分5.44ミリリットルの流量に対応し、続いて1分あたり10ダイン/平方センチメートルのせん断応力で連続流れ、毎分10.85ミリリットルの流量に対応します。バランスのとれた貯水池のポンプを制御します。接続されたチャネルスライドを備えた流体ユニットを、摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れてください。
顕微鏡ソフトウェア制御を開始し、適切なフィルタ設定を選択して蛍光顕微鏡モニタリングの原理設定を調整します。顕微鏡の視覚化のために、37°Cの暖房室に流体単位を置く。予熱顕微鏡のステージ上にチャネルスライドを置きます。
細胞の形態と、ヒスタミンおよび細菌を流れの循環に注入する前にHUVEC層の完全性を制御する。フロー設定を維持します。100ミリモルヒスタミンストック溶液の136マイクロリットルを注入ポートを介して、灌流チューブ内を循環するECGMS培地に注入することによって、内皮生存可能なパラド体からのVWFの放出を誘導する。
多量体化されたVWFストリングの蛍光検出のために、200マイクロリットルのPBSの容量のVWF特異的FITCコンジュゲート抗体をECGMS培地の循環13.6ミリリットルに注入する。HUVEC細胞表面で生成されたVWF弦への肺炎球菌の付着を定量化するには、噴射口を使用して、最大体積1ミリリットルのニューモコクシを発現する1ミリリットルRFPあたり1.35倍から8番目のCFUを注入します。顕微鏡拡大のための63X油浸漬目的を選択し、540ナノメートル検出フィルタを用いてRFPチャネルにマイクロスコープソフトウェアの蛍光フィルタ設定を調整し、プネモコクシを発現するRFPを検出します。
VWF文字列への細菌の付着の定量のために、約10の形態学的に無傷のHUVECを含む少なくとも30の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、肺炎球菌の量を数える。免疫蛍光染色前に固定後の細菌の付着を評価するには、流れを止め、ポンプ貯留層から10ミリリットルのECGMS培地を取り出し、5%パラホルムアルデヒドを添加したPBSの10ミリリットルを加え、原稿に従って進める。このプロトコルでは、原理的な実験ステップは、細胞培養フラスコにおける亜合流に対する一次内皮細胞の培養前から始まる。
次いで、細胞をゼラチンコーティングされたチャネルスライドに播種する。細菌は寒天プレート上で増殖し、続いて複雑な液体培地から中ログ相で培養する。マイクロ流体細胞培養の場合、内皮細胞を有するチャネルスライドは、ポンプシステムの流体ユニットの灌流管に接続され、細胞分化のために一定の流れに供される。
VWFストリングの生成は、1平方センチメートルあたり10ダイン秒のせん断応力でヒスタミン注入によって誘導され、FITC標識VWF特異的抗体を用いた免疫蛍光検出によって顕微鏡的に監視された。循環媒体に赤蛍光タンパク質発現性細菌を注入した後、VWF弦への肺炎球菌の付着は、450ナノメートルでの蛍光発光によりリアルタイムに顕微鏡的に可視化した。PFAを用いた細胞の固定後、免疫蛍光染色の差動は、特定の感染時の細菌の付着点の可視化を提供する。
この手順の最も重要なステップは、生理学的せん断応力レベルを調整し、極端なポンプ圧力変動を回避することによって、スライド表面に密閉された細胞の取り付けを確保することです。顕微鏡可視化に加えて、この技術は、新しい抗感染の薬理学的効果を研究し、また血管感染プロセスの長期的な結果を分析するために適用することができる。このポンプシステムはエアロゾルを介して任意の伝達を防ぐために空気圧によって細菌の病原体を浸透させる。
バイオセーフティの注意事項に従うことをお勧めします。
