彼女の技術支援のために氏Lailey;とヒト臍帯を提供するための、カルガリー、アルバータ州のフットヒルズ病院部51我々は博士ピナColarussoとイメージングと画像解析とその支援のためのライブセルイメージング施設に感謝します。健康ソリューションサイエンティスト：博士KDパテル氏はアルバータ州革新です。この作品は、イノベーションとアルバータ州科学·研究機関のカナダの財団からの健康研究機器やインフラの助成金のためのカナダの研究所からのオペレーティング·助成金によって支えられている。

1。ヒト血管内皮細胞の単離とメンテナンス<ol><li>ヒトの血液や組織で作業する場合、レベル2バイオセーフティ手順を使用する必要があります。はさみを使用すると、胎盤から臍帯を切断し、密接に血栓と配信中にコードをクランプすることにより生じた損害についてコードを確認します。切り出し、コードのこれらの部分を破棄します。 </li><li> 50mgのコラゲナーゼを含むチューブに暖かいコードバッファの50ミリリットルを注いで1 mg / mlを新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製します。 </li><li>滅菌手袋に変更し、層流フードで滅菌鈍カニューレ、コードクランプ、はさみ、三方ストップコックとガーゼを含むオートクレーブ機器のトレイを開きます。 </li><li> 2動脈と脊髄内の単一の静脈に存在を識別します。動脈は小さく、静脈が大きく、カニューレを挿入するのは簡単であるのに対し、しっかりとくびれになる傾向があります。静脈から血液をフラッシュするには、軽くiに接続された2つの三方活栓とカニューレを挿入しますNTO静脈の一端との位置にしっかりとそれを保持するために、カニューレの周りにクランプを配置します。静脈を介してコードバッファを灌流。流れが鮮明になるまで繰り返し、その後、コードの端をクランプします。 </li><li> 、静脈内にコラゲナーゼ灌流コックを閉じ、10分間のウォームコードバッファとインキュベートを含むビーカーにコードを配置します。 10分後に、コードを外し、ゆっくりと静脈の内腔から内皮細胞を緩めるためにコードをマッサージします。内皮細胞培地（ECM）を含むチューブに溶液を排出します。二回、残りの細胞を除去するためにコードのバッファーで洗い流す。同じチューブ内に溶液を排出します。 </li><li>ペレットに10分の内皮細胞は350 xgで細胞を遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、ペレットにECMの10ミリリットルを追加します。穏やかにECMに細胞を再懸濁し、0.2％ゼラチンで予めコーティングされたT75フラスコに細胞を移す。ゼラチンとプレコーティングは37℃で少なくとも1時間行われました37℃で細胞を培養℃、5％がCO 2を 。 </li><li>次の日、静かに、任意の赤血球はその後上清を除去し、暖かいハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し取り除くために、フラスコを振る。 HBSSを除去し、暖かいECMの10mlで細胞を供給します。赤血球が削除されたことを確認するために顕微鏡下で細胞を調べます。合流と内皮細胞の形態の程度を評価します。この段階では、内皮細胞は液胞のない記号で伸長する必要があります。 </li><li>細胞は、1mMのEDTAを含むトリプシンの0.08％溶液を用いて、コンフルエントにし、分割細胞に到達するまで3日ごとにメディアを変更し続けています。希望のお料理のプレート内皮細胞は、0.2％ゼラチンで予め被覆された。細胞は3-6日でコンフルエントに到達する必要があります。 </li><li> 0.2％ゼラチンで各チャンバibidi室、プレコートを使用する場合。削除過剰1.5 Xチャンバー内にECMに懸濁し、内皮細胞の10 6 / mLを追加し、ゼラチンとフィブロネクチンと。 Cまで、一日おきにメディアを変更するonfluent。細胞は、脊髄に応じて2〜3日でコンフルエントでなければなりません。 </li></ol> 2。好中球の準備<ol><li>好中球密度遠心分離を使用して、健康なヒトボランティアの末梢血から単離した。好中球分離のための視覚的なデモンストレーションの詳細なプロトコルは、このジャーナル6の以前の問題で見つけることができます。 0.5パーセントのヒトアルブミンを含むHBSSで1×10 6 / mLの濃度を一度に分離され、再懸濁し、好中球。 </li></ol> 3。 Ibidi会議を設定する<ol><li>ゼラチンコートibidiチャンバー内に内皮細胞を成長させる。彼らは緊密にコンフルエントになるまで、位相差顕微鏡を使用して、毎日それらを調べます。 </li><li>接着と活性化分子の発現を増加させる内皮細胞を刺激します。このプロトコルの目的のために、内皮細胞は37℃で4時間、組換えTNF-αのは10 ng / mLで刺激された℃、5％CO <sub前のフロー条件下でのイメージングのためのibidi室をセットアップする&gt; 2。 </li><li>顕微鏡、視覚的に空のibidiチャンバーを使用してビーゼら11で説明したようにシリンジポンプを準備します。 </li><li>このプロトコルとビーゼ手順の重要な相違点は、°Cの温度を失い、別のを使用してからバッファを維持するためにPharMedチューブを使用して、水浴を用いて37℃でバッファを維持し、空気への内皮細胞の曝露を防止するために、事前に充填チューブを含む位相コントラストまたは蛍光でイメージングするかどうかに応じて顕微鏡での目標。 </li><li>一度顕微鏡が設定され、チューブをHBSSで満たされている、すべてのコックを閉じて空のibidi室を削除します。 </li><li> TNF-αを含むibidi室がチューブに内皮細胞を刺激して接続します。 </li></ol> 4。好中球の動員と移住<ol><li> microscの内皮細胞単層を可視化する10倍の位相差対物レンズを用いてOPE。 </li><li>希望するせん断応力（典型的に0.5から2 DYN / cm 2）をHBSSでの流れを撤回し、開始するためにシリンジポンプを設定します。 </li><li>三方ストップコックを回して孤立した好中球（1×10 6 / ml）にHBSSから入口側、スイッチ上で。 </li><li> DVDレコーダーのどちらかに接続したり、コンピュータに直接接続されたCCDカメラを用いて録音を開始します。好中球は、チャンバーを入力したときにタイマーを起動します。 4分の好中球を灌流。好中球懸濁液を3mlの合計は、単一の実験のために十分である。 </li><li> 4分後、新好中球の付着を防止するためにHBSSに切り替える。合計の相互作用、ローリングと強固な接着のためのデータが必要な場合は、10秒ごとに画像6ランダムフィールドは分4と5の間に10倍の位相差対物レンズを使用します。 </li><li> 40倍の目標に切り替えて、5〜10分の間でビューの単一のフィールドを記録します。 10分で収集し、ビューの5〜10のランダムなフィールド。 </li><li>フローを停止し、次の部屋に移動します。 </li></ol> 5。 Ibidiチャンバーを用いたフローの状況下では蛍光イメージング<ol><li>興味の蛍光プローブを用いて内皮細胞または好中球のどちらかにラベルを付けます。たとえば、アレクサ·[547]に結合した抗VE-カドヘリン抗体は、内皮細胞の接合部を可視化するために使用することができます。 </li><li>微分干渉コントラスト（DIC）および蛍光機能を備えた顕微鏡でibidi室を組み立てる。私たちは、環境チャンバーとFluoView 1000年共焦点（オリンパス）を使用します。 DICと蛍光灯の作業用に設計された対物レンズを用いてフォーカスします。 </li><li>セクション4で説明した時間経過を追いながら、ベンダー提供のソフトウェアを使用して同時DICと蛍光画像を取得します。 </li></ol> 6。好中球動員の分析<ol><li>ローリングとの相互作用、細胞の分析は、ビーゼら 11に記述されています。 </lI&gt; <li>内皮単層上を転動する好中球の割合が5秒の周期で複数のセルの直径を移動した好中球数をカウントする測定します。ローリング細胞の割合を決定するためにフィールドでの白血球の総数で、この数値を除算します。拡張機能によって、残りの細胞はしっかりと付着とみなされます。 </li><li>好中球は、特定の期間内に旅して、秒単位でその時間で割っ距離を計算することによって好中球の転がり速度を測定します。 </li><li>輪廻は、形状を変更し、組織化単分子膜10の下に移行した好中球数を数えることによって決定されます。これらの好中球は、それらが相されて明るいから変更されるという事実によって識別された場合に、組織化単分子膜10の下に相暗いことに単分子層の上に。転生細胞の数は、ビューのフィールドの合計細胞のパーセンテージとして、または、生のしびれとして表すことができる。単位面積あたりの転生の細胞の小胞体。このモデルシステムでは、一般的に好中球の50％が10分後に転生。 </li></ol> 7。代表的な結果刺激内皮細胞は好中球の動員をサポートしていません。対照的に、好中球の転がり、強固な接着と輪廻のTNF-αの結果と内皮細胞を刺激する。これらのデータの例は、 図1及び図2に示されています。 図1Aは、TNF-α刺激された内皮細胞と相互作用する好中球を示しています。これらの相互作用は、内皮細胞と同様に、（ 図2）にしっかりと付着、または転生ローリング好中球数との相互作用、好中球の総数を明らかにし、定量することができる。好中球の移住は、細胞の接合部や血管内皮細胞自体を介して発生する可能性があります。これらの二つの条件を区別するために、内皮細胞は、抗VE-Cで標識される<html> adherin抗体と輪廻はparacellularly発生またはtranscellularly（ 図1BおよびC）として記録されています。このモデルでは、実質的にすべての移住は7傍細胞である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> 図1。ibidiチャンバーを用いたフロー条件下で同時DICと蛍光イメージング。 （A）DIC画像は、新たにヒト臍帯静脈内皮細胞間で移行するヒト好中球を単離した。黄色の矢印は接着性好中球を示しています。白い矢印は、転生好中球を示しています。 （B）血管内皮細胞の接合は、アレクサ·[547]とイメージングへのコンジュゲート抗VE-カドヘリン抗体で染色した。 （C）チャネルAとBはこのモデルでは実質的にすべての転生は、傍細胞であることを明らかにするのオーバーレイを表示します。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 _content &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> 図2：血管内皮細胞が刺激を受けていない残されたまたはTNF-α、10 ng / mLので刺激した。 4時間後、パラレルプレートフローチャンバーには、アセンブルされたおよび好中球は、1ダイン/ cm 2の時を越えて灌流した。 （A）好中球の相互作用を調べ、NIHからImageJのソフトウェアを用いて測定した。総相互作用する細胞（B）は、ローリング、しっかりと付着または（C）転生のように特徴付けられた。データは3〜5の実験の平均+ SEMを表す。パネルAとCの制御およびTNFの差は有意であった（p &lt;0.001）。

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

<html>研究者は定期的に好中球の動員と輪廻を研究するために別の血管床から内皮細胞を使用しています。例としては、皮膚微小血管内皮細胞12、肝類洞内皮細胞13とヒト臍帯静脈10から内皮細胞に限定されるものではない。中でもHUVECため絶縁性と可用性のそれらの相対的な使いやすさ、幅広い人気を博した。 HUVECは、 生体内で発生する多くの内皮細胞のプロセ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬および装置 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプ1 </td><td>ワージントン</td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ドバッファ</td><td></td><td></td><td>組成：pH7.4で1mMののNaH 2 PO 4月2日のNa HPO 4緩衝液に140mMのNaCl、4mMのKClを10mMのD-グルコース</td></tr><tr><td>内皮細胞培地（ECM） </td><td></td><td></td><td>ペニシリン100単位ストレプトマイシン100μgのとL-glutamine/mlの0.3 mgを含む16％ヒト血清を添加したイーグル塩とM199 </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシングルタミン酸（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi室</td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td>プレテック</td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td>ヒトアルブミン20％溶液</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td>のCa 2 +およびMg 2 +なしHBSS </td><td>シグマ</td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td>のCa 2 +およびMg 2 HBSS + </td><td>シグマ</td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

好中球は白血球の中で最も豊富なタイプです。彼らは、自然免疫系1の本質的な部分を形成しています。急性炎症時に、好中球は、損傷部位に移行する最初の炎症性細胞である。第二に、微小血管の構造変化と血漿タンパク質のエスケープを血流から;損傷部位への好中球の動員は、血流を増加させる血管の最初に、拡張を含む段階的なプロセスである全体の好中球の第三の、ローリング、接着と輪廻内皮細胞、傷害2,3のサイトでは好中球と4番目の蓄積。 in vivoおよび in vitro の方法での広い配列は、これらのプロセスの4の研究を可能にするために進化してきました。このメソッドは、ヒト内皮細胞間の好中球の移住に焦点を当てています。 好中球遊出に関与する分子プロセスを調べるための一つの一般的な方法は、人間のnを利用する初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）5との相互作用eutrophils。好中球の分離は、他の場所で視覚的に6に記載されています、従ってこの記事では、HUVECの単離のための方法が表示されます。一度分離し、コンフルエンスまで増殖、内皮細胞接着と活性化分子のアップレギュレーションで得られた活性化されています。例えば、増加したE-セレクチンとIL-8発現7のTNF-αの結果のようなサイトカインと血管内皮細胞の活性化。 E-セレクチン媒介する好中球およびIL-8を媒介する活性化と好中球の強固な接着のキャプチャとローリング。接着好中球は転生した後。輪廻はparacellularly起こる（血管内皮細胞の接合部を介して）またはtranscellularly（内皮細胞自体を介して）することができます。ほとんどの場合、これらの相互作用は、血管系7,8に見られるフローの状況下で発生します。 平行平板流室は広く使用されているシステムであり、そのマイルマイク流体力学的せん断は、 生体内に存在し、in vitroで 9,10 のフロー条件の下で好中球動員の研究を可能に強調しています。いくつかの企業は、平行平板フローチャンバーを生成し、それぞれに長所と短所があります。蛍光イメージングが必要な場合は、ガラスや光学的に類似したポリマーは、使用する必要があります。内皮細胞は、ガラス上でうまく育たない。 ここでは、位相コントラスト用に匹敵する光学特性をヒト内皮細胞の急速な付着と成長をサポートしているポリマーで作られた低容量ibidiチャネルスライドを用いて好中球遊出のDICと蛍光イメージングを簡単かつ迅速な方法を提示するガラス。この方法では、内皮細胞を増殖させたとibidiのμslideで刺激した。好中球は、フロー条件下で導入され、輪廻を評価した。接合部の蛍光イメージングは​​、対傍細胞の範囲のリアルタイム測定を可能にし経輪廻。

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K ビュー.  University of Calgary. この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

免疫・感染学

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...