これは、商業的なセットアップを使用して、機能可能な、近赤外線発光光発光金ナノクラスターとその検出の合成のための簡単なプロトコルです。この技術の大きな利点の1つは、金ナノクラスターの表面にチオール機能性リガンドの付着とアミン機能化リガンドのカップリングが光発光特性およびコイル安定性に悪影響を及ぼさないということです。強烈な光発光特性と生体分子との結合を組み合わせて、低濃度アニリド、バイオセンシング、ゾルブリング、バイオイメージングのインビトロ検出が可能になると想定できます。
手順を実証することは、私の博士課程の学生、クラウディア・クヴァコワです。フローサイトメトリーは、研究助手アルツベタ・マグドルレノワによって実証されます。顕微鏡部分は、レンカ・リブソワ研究所の大学院生であるヴァツラフ・ボカンによって実証されます。
2モル水酸化ナトリウム60マイクロリットルに7.8ミリグラムのチオクト酸を23.4ミリリットルの超純水に加え、完全に溶解するまで混合物を攪拌します。次に、10.2マイクロリットルの水素テトラクロラーレートを溶液に加え、15分後に、精力的に攪拌しながら、作りたての水素化ナトリウム480マイクロリットルを加えます。反応混合物を一晩撹拌し続ける。
翌日、3キロダルトンの分子量カットオフで3サイクルの限外濾過を使用して溶液を精製し、溶液に15.6ミリグラムのチオール末止めポリエチレングリコールを加え、pHを7~7.5の間に調整し、混合物を一晩攪拌してナノクラスター1を得る。翌日、遠心分離とろ過の3サイクルを繰り返し、分散液を浄化する。ナノクラスター1溶液をTPPと混合し、1モル塩化水素でpHを4.5に調整します。
過剰なEDC HCLを加えて反応を開始し、最初の1時間の混合物のpHを監視する。pHが6を超える場合は、塩化水素を加えて減らします。反応混合物を室温で一晩かき混ぜる。
翌日、先に説明したとおりに3サイクルの遠心分離及び濾過を行い、ナノクラスター2を得る。24ミリリットルの体積に超純水で2を希釈します。12ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり20,000個の細胞の密度で播種します。
48時間インキュベートし、培地を吸引し、400マイクロリットルの完全な培養培地を1ウェルあたり500マイクログラムのナノ粒子の有無にかかわらず添加する。ナノクラスターの内在化のために、セルを摂氏37度のインキュベーターに戻します。2時間後、標準的なトリプシン法で細胞を取り外します。
ポリプロピレンマイクロ遠心分離チューブと遠心分離機で350倍gと摂氏4度で5分間収集します。原稿の方向に従ってFCMバッファーを調製し、細胞ペレットを洗浄するためにバッファーの1ミリリットルを使用します。さらに5分間細胞を遠心分離し、FCMバッファーの500マイクロリットルで再中断し、摂氏4度で保存します。
サンプルを取得する前に、機器に対応する光学構成があることを確認してください。780オーバー60バンドパスフィルタを405A検出器の前に置きます。セルストレーナーキャップ付きの5ミリリットルポリスチレンラウンドボトムチューブを使用して、すべてのサンプルをフィルタリングします。
サイトメーターの構成を指定します。FSC-AとSSC-Aの2パラメータドットプロットをプロットして、セルの分布を示します。ダブレットを除外するには、FSC-H 対 FSC-A の 2 パラメータのドットプロットを作成し、蛍光チャネル領域の単一パラメータヒストグラムをプロットして、サンプル内の相対的な蛍光強度を監視します。
一致するイベントを最小限に抑えるために、未処理のサンプルを低い流量で取得します。取得中に、PMT 電圧を調整して、FSC と SSC プロットで未処理の母集団をスケールで取得します。必要に応じて、FL チャンネルの PMT 電圧を調整して、染色されていない母集団をヒストグラムの左隅に配置します。
次に、ソフトウェアの特定のゲートタブを選択し、希望の人口の周りに適切なゲートを描画します。ゲート内のセルは次のチェックポイントに移動します。実験を設定し、データを記録します。
播種後24時間で、HeLa細胞を含む培地0.5ミリリットルを含む各皿チャンバーに2の100マイクログラムを加える。皿をインキュベーターに戻し、細胞がナノクラスターを内部化できるようにし、その後、培地を捨て、プリウォームされた新鮮な培地で細胞を洗います。各チャンバーに800マイクロリットルの新鮮な培地を充填し、イメージングを進めます。
細胞を画像化するには、プラン APOCHROMAT と 63x 油対物レンズを使用して共焦点顕微鏡を使用します。チャンバーを摂氏37度まで温め、加湿した5%の二酸化炭素雰囲気を供給して、逆化されたステージに皿を取り付けます。適切なビームスプリッターで2%のパワーに設定された405ナノメートルレーザーを使用して、内部化された金ナノクラスターを検出し、650〜760ナノメートルの間の検出波長範囲を設定します。
画像の解像度を 2048 x 2048 ピクセルに設定します。取得速度設定では、約4マイクロ秒のピクセルドウェル時間を目指し、2回の平均で画像を取得し、ピンホールを1つのエリアユニットに設定し、より高い感度のために光子カウントモードを使用します。DICによる照明と透過光を正しくするためには、コーラーのコンデンサーとフィールドストップの設定を使用してください。
透過光を得るためには、蛍光検出器を割り当てずに0.7%の電力で488ナノメートルのレーザーを使用し、レーザー波長に適したビームスプリッターを設定してください。吸収スペクトルは、金ナノクラスター1および2が特徴的な表面プラズモンバンドを有しておらず、550から850ナノメートルまでの広い放出を示すことを示した。光発光は、TPPを1の表面に付着した後に強く増加した。
ナノクラスターからの放出も365ナノメートルのUV光下で見られた。発光は安定しており、その波長は励起波長とは無関係であったが、UV光で励起した場合、強度は最大であった。フローサイトメトリーは、HeLa細胞によるナノクラスター2の取り込み確認に用いた。
近い蛍光はナノクラスター2のインキュベーション時間と濃度の両方に依存していた。細胞内の金ナノクラスターを、標準的な共焦点レーザー走査顕微鏡で非侵襲的に画像化した。ナノクラスター2で染色した細胞と、24時間のインキュベーション後、細胞内で真っ赤な光発光が観察された。
このプロトコルを試みるとき、未反応および加水分解されたホウ水素ナトリウムの除去は非常に重要であり、そうでなければ、チオラ化ポリエチレングリコールは金ナノクラスターの表面に結合しないことを覚えておくことが重要です。さらに、金ナノクラスターの光発光は560ナノメートルから始まります。共焦点顕微鏡実験でのバックグラウンド自己蛍光を避けるために、光子は650ナノメートル以上に集める必要があります。
