Name: preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
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この作品は、部分的にERANET +プロジェクトLUSバブルとBI-TREの枠内Regioneトスカーナと欧州共同体によってサポートされていました。

注：金ナノロッドの全ての濃度は、公称のAuモル濃度で表されています。他の作品との比較のために、1 M Auをおおよそ我々の場合には、20μMの金ナノロッドに対応していることに注意してください。 カチオン性金ナノロッドの作製注：この方法は、Ratto ら 26に従ってNikoobakht ら 25によって導入され、適応プロトコルに従って、アスコルビン酸とのHAuCl 4の自己触媒還元によるセトリモニウムブロマイド（CTAB）-capped金ナノロッドの合成を開始します。これらの金ナノロッドは、ポリエチレングリコールの組み合わせ10、11、27、28及び第四級アンモニウム化合物22を鎖によって、血漿膜のためのより多くの生体適合性および親和性を得るために変更されます。 <ol><li> concentratioで24ミリリットルCTABをかぶった金ナノロッドを精製遠心分離の2つのサイクル（12,000×gで、30分）し、デカンテーションによって、450μMのAuのn個。初期体積へのデッドボリュームの比率は、このプロトコルですべての遠心操作のために周りの1/200以下であることを確認します。洗浄液として、500μMの水性CTABを使用し、最終的に500μMCTAB及び0.005％（v / v）のポリソルベート20を含むpHが5で6ミリリットルの100mM酢酸緩衝液中に粒子を移します。 </li><li> 30μlの10mMの水性アルファ - メトキシ - オメガ - メルカプト - ポリ（エチレングリコール）（MW〜5,000）を加え、37℃で30分間反応さ残します。 </li><li>ジメチルスルホキシド、N、N、N -トリメチルアンモニウムブロマイド、37℃で24時間安静に残す- 30μlの100 mMの（11-メルカプトウン）を追加します。 </li><li>次に、水18 mlの0.005％（v / v）のポリソルベート20を追加して、遠心分離の4サイクル（12,000×gで、30分）、デカンテーションすることによって、これらの粒子を精製します。洗浄液として、水に0.​​005％（v / v）のポリソルベート20を使用して、最終的にpHで2.4 mlの滅菌PBS中に粒子を移します7.4。金の最終名目濃度は4.5 mmです。 </li></ol>ゴールドナノロッドとマウスマクロファージの2のロード<ol><li> J774A.1し、DMEM、10％ウシ胎児血清、1 mMグルタミン、100単位/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンのような培養培地を補充した単球/マクロファージ細胞株を使用してください。プレート直径60mmの4ペトリ皿中で5×10 5細胞及び剥離時のサブコンフルエントするように彼らは、24時間成長させる（ステップ2.2参照）。 <ol><li>プロトコルを通して、標準培養条件（37℃、5％CO 2、95％空気および100％相対湿度）で細胞を維持します。細胞を操作するためにクリーンベンチ、適切な個人用保護具を使用します。 </li></ol></li><li> 24時間後、キトサンフィルムに埋め込まれるように、カチオン性金ナノロッドで細胞をロードし、それらを準備します。 <ol><li>粒子が細胞によって取り込まれることを可能にするために、4.5のアリコートを加えます各ペトリ皿にmMのPBS中のAuのカチオン性金ナノロッドは、100μMのAuの最終濃度を達成するようになっています。 24時間のインキュベーションにペトリ皿のままにしておきます。 </li><li>次に、それらの良好な条件とアップロードを確認するために、光学顕微鏡で細胞を観察します。細胞は、その正常な形態と暗細胞内小胞の数を示すべきです。以下の工程（少なくとも2×10 6細胞）を、細胞の適切な量を達成するために、2つのペトリ皿からそれらをマージし、スクレーパによって細胞を剥離し、いずれかを排除するためにそれら（120×gで6分間）遠心カチオン性金ナノロッドの過剰。携帯ペレットはほとんど黒になります。 </li><li> 2mlのPBSでペレットを中断し、Bürker室を利用して細胞を数えます。遠心分離機2×10 6個の細胞（120×gで、6分）し、室温で10分間、PBS中のホルムアルデヒド（w / v）の2ミリリットル3.6％で、そのペレットを修正を含む懸濁液。最後に、centrifugatすることにより、このペレットを3回洗浄固定液を除去するためにイオン（120×gで、6分）。洗浄液としてPBSを使用してください。 </li></ol></li></ol>キトサンフィルムへのマクロファージの3埋め込み注：キトサン26、27、28の固有の特性、29はカチオン性金ナノロッドを用いて染色したマクロファージを含有する生体模倣ファントムを生成するために利用されます。アガロースなどの他のヒドロゲルに関しては、キトサンは、PA顕微鏡6のために重要である、はるかに強いと薄いフィルムを可能にします。これらのファントムの製造は、以下の30の規定にいくつかの変更を加えて31、以前のプロトコル29、30に従って行われます。 <ol><li>酸性化した（酢酸の添加により得られるpHは4.5）及び粘性を3％（w / v）の低分子量のキトサン（平均分子量120 kDaの）溶液を調製し、十分に混合しそれは40℃で24時間均質化させ。 </li><li>次に、キトサン溶液500μlを有するカチオン性金ナノロッド（2×10 6細胞）を含む、マウスのマクロファージを混ぜます。 </li><li> 、〜50μm厚のファントムを得る1.91センチメートル2ポリスチレン型に混合物の250ミリグラムを注ぎ、24時間窒素気流下でそれらを残すために。その後、架橋を誘導するために、500μlの1 M NaOHを用いてこれらのサンプルを処理し、超純水10mlでそれらをすすぎます。 </li></ol>光音響変換の安定性4.テスト注：PA変換の安定性は、参考文献6に記載されている自家製のセットアップとPA実験によって調べました。 <ol><li>プレートの底から〜5mmの間隔を保つように、ペトリ皿に浸漬プラスチックホルダーを使用することによって、例えば脱イオン水でマクロファージを含むキトサンフィルムを、サスペンド。このプレートは、マイクロメートルのXYステージ上に置きます試料の位置を制御するためです。 </li><li> 2500 - 400の波長範囲でYAGレーザー：QスイッチNdの第三高調波で励起光パラメトリック発振器から、 例えば、金ナノロッド（の縦プラズモンバンドと共鳴〜5ナノ秒のパルス持続時間を有するレーザービームをフォーカス〜300μmのスポット径を有する膜面に垂直nmおよび5ナノ秒のパルス持続時間）。 <ol><li>レーザフルエンス調整するために、レーザー出口の前に減衰器を配置し、エネルギーメーター（ 例えば 、焦電検出器）にレーザービームの一部を集中し、フルエンスの変動を監視するために、ビームスプリッタを使用しています。アライメント時パルスあたり〜1ミリジュール/ cm 2の下の光フルエンスを維持します。レーザーがオンになっていれば、適切なレーザー安全メガネを使用してください。 </li></ol></li><li>フィルム表面から約2 mmのペトリ皿に及びマイクロメートルの翻訳を使用してその位置を調整する - 超音波振動子（20から1MHzの周波数範囲）に浸し回転ステージは、膜から放出されたPA信号を最大化します。 </li><li>試料6に損傷を与えないプローブフルエンスF LOを決定します。 <ol><li> 1 MJ /少なくとも500パルスのパルス当たりcm 2の周りのフルエンスでサンプルのランダム点を照射します。各パルスは、オシロスコープと電力量計からの超音波トランスデューサとレーザフルエンスから対応するPA信号を取得します。 F LO トライアルとして平均フルエンスに名前を付けます。 </li><li>パルス数の関数としてのピーク・ツー・ピーク振幅としてPA信号の強度を算出します。レーザ強度の変動をカウンタウエイトにするために、F LO 試験への独自のフルエンスの割合各PA信号の振幅を正規化します。パルス数の関数としての正規化されたPAの強度の傾向を分析し、時間をかけてその安定性を検証します。 </li><li>不安定性の場合には、繰り返しはF LOの低い値と4.4.3に4.4.1ステップ<s&gt;裁判アップ。安定性の損失が発生するまで、安定性の場合には、〜10％高いF LO 試験の値でそれらを繰り返します。安定性を保証F LO 試験の二番目に高い値としてプローブフルエンスF LOを設定します 。 </li></ol></li><li>整形閾値フルエンスを測定します。 <ol><li>サンプルの別のランダム点を選択し、平均PA強度F LOで（I LO a）は、500を超えるパルスを探ります。 </li><li> F LOよりも大きい公称フルエンスを設定し、50パルスを提供します。 F EXCとしての平均フルエンスに名前を付けます。 </li><li>プローブ再びF LOで500パルスにわたって平均PA強度（I LO b）は 。比R = I LOの B / I LO計算します。団結以下のRの値は、サンプルの光学特性の不可逆的な変化の証拠を提供します。 </li><li>フィルムを移動させるために、マイクロメートルXYステージを使用して、POINを変更ランダムにサンプルのトン。周りと団結の上、下記のRのいくつかの値をとるように繰り返して、F EXCの異なる値と4.5.4に4.5.1を繰り返します。 15点が妥当です。 </li><li> FのEXCの関数としてプロットRおよびRは、統計的不確実性を超えたものと異なるし始めると、その値として番目の整形の閾値フルエンスFを識別します。6 </li></ol></li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

腫瘍関連マクロファージを標的とする概念は、癌34、35、36に対抗するために強力な概念として浮上しています。ここでは、代わりにその破壊のために、これらの細胞は、その親和性の活用により、腫瘍に金ナノロッドをもたらすために携帯車として採用されています。この視点は、粒子の思慮深い設計、細胞とその特性評価への統合を必要とします。...

過去10年間、金ナノロッド、ナノシェル及びナノケージ等の種々のプラズモニック粒子は、生物医学的光学系1、2、3、4における用途のために、かなりの注目を集めています。標準の金ナノスフィアと分散では、これらの新しい粒子が身体を通して最も深い光浸透し、内因性の構成要素1を超える最高の光学コントラストを提供し、近赤外（NIR）ウィンドウで共振します。この機能は、光音響（PA）イメージングおよび癌の光熱アブレーションなど革新的なアプリケーションのための関心を呼んでいます。しかし、いくつかの問題は、これらの粒子の臨床的浸透を抑制する。例えば、それらの光活性化は、その過熱を誘導するために、より球状photoinstability 5を駆動プロファイル、6、7、8に向かってそれらの機能的形状を変更する傾向があります</SUP&gt;、9。科学的な議論を支配するもう一つの問題は、腫瘍へのそれらの全身送達です。具体的には、金ナノロッドは、強化された透過性と保持および悪性マーカーの特異的プローブとの結合の容易さを表示する腫瘍に浸透するのが理想的であるサイズを兼ね備えています。従って、血流への直接注射のためのそれらの調製が可能スキーム10、11、12、13として知覚されます。しかしながら、この経路は、粒子の大部分は、単核食細胞系10、11、12により捕捉さになって、問題が残ります。また、別の懸念は、本体14を通って循環した後の粒子の光学的および生化学的安定性です。粒子は、それらのコロイド安定性と凝集体を失うとき、彼らのプラズモニック機能や伝熱力学は、プラズモニックカップリング15に苦しむことがあり、 </s&gt; 16、17、最大18クロス過熱。 より最近では、腫瘍関連マクロファージの親和性を利用する概念は、スマート代替19、20、21として浮上しています。これらの細胞は、高い特異性で腫瘍を検出し、みなぎるする生得的な能力を保持します。したがって、1観点は、患者からこれらの細胞を単離し、in vitroでの金ナノロッドでそれらをロードし、配達を担当する携帯車としてそれらを使用することを意図して、患者に戻ってそれらを注入することであってもよいです。もう一つの利点は、それらの生物学的インタフェースをin vitroで構築されるため、粒子の光学的および生化学的安定性をより細かく制御を獲得することです。それでも、光造影剤としてのこれらの細胞の車両の性能は、批判的な分析を必要としています。 本研究では、準備とcellulの重要な問題について説明します癌のPAイメージングのための金ナノロッドを含むAr車。 PEG化された金ナノロッドは、血漿膜23,24との相互作用を促進することが期待されているカチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物22で修飾されています。これらの粒子は、うまくいけば、それらの生物学的機能をあまり干渉することなく、ほとんどの携帯の種類の中から効率的かつ非特異的取り込みを受けます。マウスマクロファージはタイトエンドサイトーシス小胞内に閉じ込めなっセルあたり最大000、200のようなカチオン性金ナノロッド、までにロードされます。この構成は、これらの小胞の内部のプラズモンカップリングとクロス過熱の恐れの、懸念を生じなければなりません。したがって、マクロファージは、粒子のPA転化の安定性の大部分はエンドサイトーシス小胞の成長培地からの転送中に保持されていることを確認するために、生体組織を模倣する生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています。 EffectivEの測定基準は、PAイメージングのための即時の関心の条件下でPA変換の安定性を測定するために働いています。再形成閾値は10ヘルツの典型的な繰り返し率を有する50のレーザパルス列の後に、光不安定性の非常に開始時に設定されています。 私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための勢いを提供することができることを確信しています。

<table><tbody><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>To synthesize gold nanoseeds</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>To PEGylate gold nanorods</td></tr><tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>To solubilize (11-mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>To centrifuge PEGylated gold nanorods</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Monocyte/macrophage murine cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Cell culture dish</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>To detach cells</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>To fix cells</td></tr><tr><td>Chitosan, low molecular weight</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td></tr><tr><td>Polystyrene cell culture plates</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td></tr><tr><td>Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Source of optical excitation for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pyroelectric detector&amp;nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pre amplified needle hydrophone</td><td>Precision Acoustic, Dorset, UK</td><td>Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td><td>To measure photoacoustic signals</td></tr></tbody></table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

金ナノロッドは、腫瘍への家庭への近赤外窓、低細胞毒性および電位の彼らの強烈な光吸収率のおかげで、このような光熱アブレーションおよび癌の光音響イメージングなどの生物医学的用途の範囲のために魅力的です。しかし、腫瘍への配信はまだ問題が残っています。革新的なアプローチは、in vitroでの金ナノロッドを装填できる腫瘍関連マクロファージの親和性の搾取から構成されています。ここでは、準備金ナノロッドを含む細胞の車両の光音響検査について説明します。 PEG化された金ナノロッドは、カチオン性プロファイルを達成するために、第四級アンモニウム化合物で修飾されています。通常のペトリ皿におけるマウスのマクロファージと接触すると、これらの粒子は、エンドサイトーシス小胞に大量の取り込みを受けることが分かっています。次に、これらの細胞は、その音響変換の安定性を確認するために使用される生体高分子ヒドロゲル中に埋め込まれています粒子の携帯車へのそれらの包含に保持されています。私たちは、これらの結果は、腫瘍へのプラズモニック粒子を提供するための新規戦略の開発のための新たなインスピレーションを提供することができることを確信しています。

ここでは、癌のPAイメージングのために金ナノロッドを含む細胞の車の可能性は、プロトコルの代表的な成果と一緒に示されています。 図1のTEM画像は、ステップ2の粒子のとTEMイメージングのための細胞の調製は、別の場所で17説明された後、ステップ1後の粒子およびそれらの細胞の車の通常の外観?...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K ビュー.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

周囲条件下での金ナノ粒子の安定オリゴマークラスターのサイズ制御された合成のための簡単​​な方法

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

化学

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

金ナノロッドのヒドロキノンベースの合成

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Construction and Operation of a Light-driven Gold Nanorod Rotary Motor System

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and artificial nanomotors and may provide new routes towards single cell analysis, studies of non-equilibrium thermodynamics, and mechanical actuation of nanoscale systems. A facile way to drive rotation is to use focused circularly polarized laser light in optical tweezers. Using this approach, metallic nanoparticles can be operated as highly efficient scattering-driven rotary motors spinning at unprecedented rotation frequencies in water.
In this protocol, we outline the construction and operation of circularly-polarized optical tweezers for nanoparticle rotation and describe the instrumentation needed for recording the Brownian dynamics and Rayleigh scattering of the trapped particle. The rotational motion and the scattering spectra provides independent information on the properties of the nanoparticle and its immediate environment. The experimental platform has proven useful as a nanoscopic gauge of viscosity and local temperature, for tracking morphological changes of nanorods and molecular coatings, and as a transducer and probe of photothermal and thermodynamic processes.

Plasmonic gold nanorods can be trapped in liquids and rotated at kHz frequencies using circularly-polarized optical tweezers. Introducing tools for Brownian dynamics analysis and light scatteringspectroscopy leads to a powerful system for research and application in numerous fields of science.

金ナノロッドの光駆動ロータリー モーター システムの構築と運用

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and ...

工学

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

生化学

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

神経科学

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

タンパク質局在解析のための金ナノ粒子の直接合成

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various physiological or pathological processes in all living organisms. Therefore, the development of clonable tags that can be used as electron microscopy probes is of great value, just as fluorescent proteins have played a crucial role in the field of optical imaging. The autonucleation suppression mechanism (ANSM) was recently uncovered, which allows for the specific synthesis of gold nanoparticles (AuNPs) on cysteine-rich tags, such as metallothionein (MT) and antifreeze protein (AFP).
Based on the ANSM, an electron microscopy labeling technology was developed, which enables the specific detection of tagged proteins in prokaryotic and eukaryotic cells with an unprecedented labeling efficiency. This study illustrates a protocol for the detection of MTn (an engineered MT variant lacking aldehyde-reactive residues) fusion proteins in mammalian cells with well-preserved ultrastructure. In this protocol, high-pressure freezing and freeze-substitution fixation were performed using non-aldehyde fixatives (such as tannic acid, uranyl acetate) to preserve near-native ultrastructure and avoid damage to the tag activity caused by aldehyde crosslinking.
A simple one-step rehydration was used prior to the ANSM-based AuNP synthesis. The results showed that the tagged proteins targeted various organelles, including the membranes and the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and mitochondrial matrices were detected with high efficiency and specificity. This research provides biologists with a robust protocol to address an enormous range of biological questions at the single-molecule level in cellular ultrastructural contexts.

著者スポットライト:細胞内でのEM可視金ナノ粒子の直接合成による、保存状態の良い超微細構造によるタンパク質局在解析(英語)  

The present protocol describes a clonable electron microscopy labeling technology for detecting metallothionein-tagged proteins in cells using a novel autonucleation suppression mechanism-based gold nanoparticle synthesis technique.

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

要約

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シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

周囲条件下での金ナノ粒子の安定オリゴマークラスターのサイズ制御された合成のための簡単な方法

金ナノロッドのヒドロキノンベースの合成

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

金ナノロッドの光駆動ロータリーモーターシステムの構築と運用

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

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