我々は、グループIVウイルスゲノムが宿主タンパク質配列の短い伸びをコードすることを示した。これらの配列は、ウイルス性プロテアーゼ切断部位内に見つけることができる。彼らは、宿主タンパク質の標的破壊、典型的には免疫応答の生成に関与するタンパク質に使用されています。
プロテアーゼアッセイを使用する主な利点は、細胞の複雑さを除去し、ウイルスプロテアーゼが特定の配列を切断できるかどうかを示すということです。そこでジカSSHHPS配列を分析したところ、プロテアーゼは免疫応答の生成に関与するタンパク質の配列を切断することができ、これらのタンパク質のいくつかは脳と眼の発達にも役割を果たしていることがわかりました。この技術を初めて行う場合、切断が観察されない場合、プロテアーゼの活性などの様々な要因による可能性があることを覚えておくべきである。
手順を実証することは、私の研究室の技術者であるジェイミー・コンプトンです。プロテインBLASTを開き、scissile結合とウイルス性ポリタンパク質を取り巻く20個のアミノ酸を入れ、非冗長タンパク質配列を選択して、検索する宿主ゲノムに入力します。必要に応じて、PHI-BLAST を選択し、角括弧が、ブラケット内のいずれかのアミノ酸が代替位置に配置できることを示すパターンシーケンスを入力し、BLAST をヒットします。
ランクは、切断部位のシーケンスに一致する連続した同一または許容残基の数に基づいてBLASTヒットを順序付けます。リストから、プロテアーゼアッセイで分析するために6つ以上の同一または類似の残基を含むタンパク質を選択します。シアン蛍光タンパク質をコードするプラスミドを構築し、切断配列の最大25個のアミノ酸、および黄色の蛍光タンパク質を構築する。
次に、CFPおよびYFP基質を、一晩培養した25ミリリットルの4つのフラスコを接種して調製する。37°Cで文化を振り、600ナノメートルのUV-Vis分光法によって毎時成長を監視します。細菌が約1の吸光度に達したら、各フラスコに1つのモルIPTGの0.5ミリリットルを加えることによってタンパク質発現を誘導し、次に振れるインキュベーターの温度を摂氏17度に下げ、17〜20時間一晩続けることを可能にする。
翌日、摂氏4度で10分間7000倍gで遠心分離して細菌をペレット化する。液体培地を取り出して捨て、ペレットをマイナス80度で保存するか、細胞のリシスを進めます。細胞を融解するには、原稿の方向に従って100ミリリットルのリシスバッファーを調製し、バッファー内のペレットを再中断し、25〜25ミリリットルの懸濁液を50ミリリットルの使い捨て円錐形チューブに移す。
氷水でプラスチックビーカーにチューブを入れ、先端がチューブの底から約1センチメートルになるように超音波処理器の先端をチューブに挿入し、溶解物が液体になるまで10〜20回超音波処理します。超音波処理後、リセートを高速遠心管に移し、摂氏4度で30分間20、500 x gの遠心分離機を行います。上清をきれいなボトルに移し、ペレットを捨てます。
溶液をニッケルカラムに積み込み、2カラムの体積のバッファAでカラムを洗浄し、続いて20%バッファBの5カラム体積を洗浄し、280ナノメートルでの吸光度は、洗浄中に280ナノメートルの吸光度が増加し、そのカラムから溶出して溶出します。A280がベースライン値に戻るまで洗浄を続けます。その後、100%バッファーBの2〜3カラム体積でタンパク質を溶出し、10ミリリットルの分画を収集し、各画分のA280を測定することを確認します。
原稿の方向に応じて8つの反応ミックスを準備し、各ミックスのピペット45マイクロリットルは、黒いハーフエリア96ウェルプレートの各行の最初の3つの井戸に入ります。固定のフォトマルチプライヤチューブ設定で2つの波長での花相の同時検出用プレートリーダーを設定します。1分に1回読み取りで20〜30分に読み取り時間をプログラムし、読み取る井戸を選択します。
プレートを機械に挿入し、読み取りを開始し、時間の経過に対する放出比を監視します。ノーカット基板を含むプレートの終点読み取りを実行します。プレートを取り出し、各井戸に酵素の5マイクロリットルをピペット。
最初の列を切り取りなしコントロールとして保存できます。その後、プレートを20〜30分間読み返し、プレートリーダーに絶対値を出力するように設定します。読み取りが完了したら、プレートをフィルムで密封して蒸発を防ぎ、室温で一晩放置して酵素が基質を完全に切断できるようにします。
24時間後、フィルムを取り出し、プレートの終点読み取りを行います。放出比率を平均し、カットとして記録します。SDS-PAGEを用いて基板の切断を確認する。
分子量マーカーを最初または最後のレーンにロードし、各反応混合物の5マイクロリットルをゲルのレーンにロードし、ノーカット反応から始めます。ゲルタンクの電極を電源に取り付け、110ボルトで60分間実行します。割れるツールを使用してカセットからゲルを取り出し、5〜10ミリリットルの染色溶液に沈めます。
1~24時間後、余分な汚れを取り除き、ゲルを水に沈めます。次に、ゲルイメージャーを使用してゲルの写真を撮ります。タンパク質構造を調製するには、タンパク質PDBファイルをMOEにロードします。
[選択と溶媒]をクリックし、溶媒を削除します。コンピュートトップメニューバーから構造pの準備パネルを開き、自動的に[修正]をクリックして、すべての構造項目を修正します。「プロトネイト 3D」をクリックして、構造をプロトネーションします。
部分電荷パネルを開き、必要に応じて「AMBER 99」と「水素と孤独なペアを調整」を選択して、タンパク質に部分的な電荷を追加します。次に、構造ファイルを保存します。基質ペプチドとTRIM14の構造を構築するには、プロテインビルダーパネルを開き、基質配列を入力し、自動再パックを選択します。
次に、[ジオメトリ]を[拡張]に設定し、[構築]をクリックします。最後に、構造を最小化し、PDB ファイルとして保存します。PyRx AudoDock 4.2ソフトウェアを使用して、基板ペプチドをVEEV-nsP2にドッキングします。
タンパク質をロードし、名前を右クリックして[マクロ分子を作る]を選択してPDBQTドッキングファイルを準備します。次に基質分子をロードし、「リガンドを作る」を選択してリガンドドッキングファイルを準備します。下部のドッキングパネルで AutoDock ウィザードを起動し、準備したリガンドとタンパク質ファイルを選択します。
グリッド寸法を手動で調整してタンパク結合ポケットを定義し、AuotGridを実行します。次に、AutoDockを実行し、ラマルキアン遺伝的アルゴリズム法を選択します。[ドッキング パラメータ] をクリックし、GA 実行数を 50 に設定し、[転送] をクリックしてドッキングの実行を開始します。
AutoDock が完了したら、[結果の分析] パネルを開き、予測されるすべてのバインド ポーズを調べます。切断部位上のcis-477と基板との間の最も低い予測結合エネルギーと合理的な結合相互作用を持つ最良のモデルを選択し、さらにMDシミュレーションのためにPDBファイルとして保存します。AutoDock でバインド ポーズを読み取った後、ドッキング後の解析を実行して、MD シミュレーションで絞り込むための妥当なバインド モデルを特定することが重要です。
このプロトコルは、ジカウイルスns2B/3プロテアーゼ中の相同の宿主病原タンパク質配列またはSSHHPSの短いストレッチを見つけるために使用された。4つの宿主タンパク質標的が同定された。FOXGS、SFRP1、retinal cDNAライブラリからのGsαサブユニット、およびNT5Mミトコンドリア5'3'ヌクレオチダーゼ。
SSHHPSの配列アライメントは、切断部位配列における種特異的な違いを認めた。SFRP1配列は、ジカウイルスが鶏の胚の死亡率と小頭症を誘発することができるので注目に値するヒトと鶏で同一であった。連続アッセイは、ウイルスポリタンパク質配列に対する定常運動パラメータおよび阻害定数を測定するために使用され、不連続アッセイは、特定の配列の切断または様々な化合物によるプロテアーゼの阻害などの質的切断情報を得るために使用した。
ベネズエラの馬脳炎nsP1-nsP2接合のモデルは、シリコ法を用いて作られた。nsP2プロテアーゼの場合、基質配列を長くし、バッファーのイオン強度を低下させることで、セムリキフォレストウイルス配列のミカリス定数の切断が大幅に減少した。この手順を実行するときは、コントロールを実行することが重要です。
ウイルスプロテアーゼ切断部位配列を含む基質は、SSHHPS配列解析を進める前に試験する必要があります。宿主タンパク質の切断が観察された場合、宿主タンパク質がウイルス複製に影響を及ぼすことを確認するためにフォローアップ実験を行う必要があります。これは、タンパク質を過剰発現またはサイレンシングし、ウイルス複製への影響を調べることによって行うことができます。
グループIVには、新しい病原体と新興病原体が多数含まれています。SSHHPS配列は、特定の宿主タンパク質および経路をウイルスプロテアーゼと非常に予測可能な方法で結びつける。
