この作品は、NoroCORE プロジェクトを通じて農業と食品研究イニシアチブ競争グラント号 2011-68003-30395 からアメリカ合衆国農務省、国立食品研究所、農業によって支えられました。オープン アクセス料金のための資金は、米国農務省によって提供されました。ロバート Atmar (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) 提供いただきありがとうございます親切私たち精製カプシドとヴァレリー Lapham の TEM 画像で彼女の援助したいと思います。提示実験を開始私たちを助けるためフランク N. バリーに感謝も申し上げます。

1 です評価損失の高次ノロウイルス カプシド構造の結合アッセイのプレート ベース 注: ここで提示されるものに非常によく似た ELASA プロトコル公開 29 日となっています。研究の一部記事他 17 , 18 , 22 として以前と同様 ELASA アッセイを報告されているとします。
<ol><li>人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理 <ol><li>を得る精製人間ノロウイルス GII.4 シドニーの主要カプシド蛋白 (VP1) (加盟: JX459908) カプシドで組み立ています 。
		注: 研究のカプシド (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) R. Atmar 礼儀得られた</li>。
		リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) 個々 の 15 μ L の最大ボリュームに × 1 で 50 μ g/mL に <li>Dilute カプシドは、PCR チューブを頂いた。チューブに少なくとも 600 が含まれていることを確認キャプシドの ng。600 があることを確認治療配位子の組み合わせごとキャプシドの ng</li>。
		<li>予熱目的の熱処理サーマルサイクラー 。
		注: このプロトコルは、別の回の 68 ° C で治療の目的のため (0 - 25 分) 選ばれた</li>。
		<li>は、即時の冷却のための 4 ° C に追加サーマルサイクラーを予熱します。希望の時間に、サーマルサイクラーにキャプシド ソリューションとチューブを追加します。すぐに加熱後 5 分間予冷 4 ° C サーマルサイクラーに転送します。
		<ol><li>含める 95年 ° C 5 分治療を変性キャプシド対照として。肯定的な制御として未処理 (23 ° C) キャプシドのソリューションが含まれます。PBS は、追加のネガティブ コントロールとしてないのキャプシド</li>。
		</ol></li> <li>簡単にスピン ・ ダウン チューブの下にすべての滴を取得して希薄 PBS で扱われたキャプシド溶液 3 μ g/mL に、遠心分離機で。希薄化後、扱われたカプシド (100 μ L/ウェル) の少なくとも 200 μ L があることを確認します</li>。
	</ol></li> <li>治療あたり少なくとも 2 つの井戸があることを確認、各ウェルにキャプシド ソリューションの適用 100 μ L。さらに、それぞれの ligand; 100 μ L の PBS で 2 コントロール井戸があります。これは、アッセイのバック グラウンドの吸光度を提供します。カバー蓋付きプレート、シール パラフィンとエッジ蒸発量を削減する映画し、のまま一晩室温で 2 h、4 ° C で揺れインキュベーターにします</li>。
	<li>0.05% で PBS で脱脂乳固形分 5% (w/v) を行うことでブロックのバッファーを準備トゥイーン 20 (pbst;).</li>
	<li>は、プレートから扱われるキャプシド ソリューションを削除します。200 μ L/ウェルのブロック バッファーを追加します。2 時間室温で孵化させなさいまたは一晩、4 で密封 ° C</li>
	準備リガンド結合ビオチン アプタマー M6 2 18 , 29 のためのソリューションとビオチン標識合成 HBGA 血液型 A またはビオチン化型 h. <li>
	<ol><li>Dilute ヌクレアーゼ フリー水 1 μ M にビオチン化アプタマー。各治療の合計 200 μ L の十分な解決策があることを確認します。30 μ g/ml ブロック バッファーに選ばれたビオチン HBGA を希釈します。各治療のため 200 μ L 容量の十分な解決策があることを確認します 。
		注: 少ない HBGA を使用するには、HBGA の 10 μ G/ml 0.25% スキムミルク PBST で置き換えることができます。ビオチン標識 M6 2 の HBGA 濃度の最適化で以前と、報告します</li>。
	</ol></li> <li>ブロック バッファーを削除し、3 回で 200 μ L/ウェル PBST プレートを洗います。残留水分を乾燥滅菌ペーパー タオルに逆さまプレートをパットします</li>。
	<li>追加 100 μ L/ウェル リガンドの結合ソリューションは熱処理配位子の組み合わせごと 2 井戸が確実します。室温で 1 時間約 60 rpm で軌道シェーカーのふたで覆われているプレートをインキュベートします 。
	注: はそれぞれ正と負のコントロールとして未処理カプシドとそれぞれの ligand のため完全に変性カプシドの各 2 井戸を含めるようにしてください。さらに、2 を &#34; ないキャプシド &#34; プレートとしてそれぞれの ligand のための井戸背景コントロール</li>。
	<li>は、リガンド ソリューションを削除し、200 μ L/ウェル PBST で 3 回洗浄します。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします</li>。
	<li>0.2 のソリューションの追加 100 μ L/ウェル μ G/ml ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ PBS で。軌道シェーカーで穏やかな揺れで室温で 15 分間インキュベートします 。
	注: 異なるストレプトアビジンを西洋わさびの過酸化酵素抱合体が異なる濃度を持っています。ユーザーを参照してください &#39; ELISA 用酵素の濃度の理想的な範囲のための s マニュアル必ずそれが最適と</li>。
	<li>共役ソリューションを削除します。200 μ L/ウェル pbst; 3 回洗います。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします</li>。
	<li>追加 100 μ L/ウェル 3, 3 &#39; 5, 5、&#39;-テトラメチルベンジジン (TMB) 基板ができ、いずれかの 5-15 分観察ネガティブ コントロール井戸色し、必ずレプリケート平板間同時に一貫して開発していく色。プレート リーダーを使用すると、同様の吸光度範囲に注意してください 。
	注: 開発の回は使用する配位子/試薬の品質に基づいて異なる場合があります</li>。
	<li>は、100 μ L/ウェル 1 M リン酸との反応の開発を停止します。板 450 で、すぐに読む nm。データを保存します 。
	注: 酸の導入は、一般的に大幅に反応が遅くなりますが、完全にそれを停止しません。吸光度の読み取りの前に時間の延長量停止板を放置しないでください</li>。
</ol> 2。プレート ベースのアッセイの結果の解析 <ol><li>は、スプレッドシート プログラムで生吸光度データを保存します。特定治療と配位子とよくペアごとに平均の結果を生成します。すべてのそれに続く分析のこれらの平均値を使用します 。
	注: 比較井戸のペアには大幅に異なる値がないことを確認する両方のよくカラムベッド</li>。
	絶対キャプシド整合性 (すべてバインディング) を分析し、生の吸光度を差し引く <li>、&#34; ないキャプシド &#34; コントロールすべての他のサンプルの吸光度値から 。
	注: また、高次 (二次、第三、第四) 構造の喪失によるバインディングの損失直接分析できます。負 (カプシドない) コントロールの吸光度を差し引くではなく完全に変性キャプシド コントロールの値を減算します。この非特異的な装置へのバインドし同様、キャプシド シーケンスによるバインドによる信号のすべてのバインドを削除します。HBGA とアプタマー M6 2、どちらの方法でも同様の結果を生成するので、ほとんどのバインディングを完全に変性キャプシドに表示されます。アプタマーの非特異的な結合に起因する偽の肯定的な信号は使用する分析を選択するとき考慮必要があります</li>。
	<li>と、負の値または変性制御調整結果、100 治療彼らのそれぞれ正 (無処理) によって吸光度吸光度を制御し、乗算で割る。これは未処理のコントロールを基準として扱われたキャプシドの信号の割合を提供します</li>。
	カプシド シーケンスに起因するそれぞれの ligand 結合信号の程度を推定する <li>を引く、&#34; ないキャプシド &#34; 負の初期の結果から制御および変性キャプシドの調整された吸光度を取る。肯定的な制御信号の調整後の吸光度でこれを割り、100 を掛けます。これは変性キャプシド/キャプシド シーケンスへのリガンドの結合により信号が明白な割合を与えます</li>。
</ol> 3。熱処理後のウイルスの凝集を検出するための DLS 注。以下の手順は、ソフトウェアに固有かもしれないと計測器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用します。
<ol><li>DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 25 ° C、平衡時間 0 秒、電池の種類を = = 使い捨てのキュベット (小さい容積、ZEN0040)、測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間自動測定の数 = 3、測定間の遅延を = = 0 秒、データ処理: 解析モデル汎用 (標準解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します</li>。
	<li>ソフトウェアでは、緑の実行ボタンを選択し、サンプルの名前します</li>。
	<li>1.1.1 群集の熱処理のための 1.1.4 からの手順に従います</li>。
	<li>Dilute 熱は、群集を 1:10 に最終濃度 5 μ g/mL の 1x PBS で扱われます。(省略可能)ダスト粒子を削除する 1 μ m の細孔径とサンプルのフィルターを適用します。DLS は、大きな粒子は小さな粒子黒より多く光が散乱、ほこりに非常に敏感です</li>。
	<li>使い捨ての小さなボリュームに希釈した群集の転送 50 μ L のキュベットです。楽器のサンプル室にキュヴェットを挿入します</li>。
	<li>実行] を起動し、使用、&#39; コレログラム &#39;、&#39; キュムラント フィット &#39; と &#39; エキスパート アドバイス &#39; データの品質を評価するためのタブ。
	<ol><li>分散インデックス値よりも小さいことを表す、品質測定で 0.3 チェックの実行、中に、&#8216; マルチビュー &#8217;] タブで、相関係数が定数と、閉じるが短時間で、1 以上を確認。・保存時は粒子の粒径特性 0 急激に低下。使用、&#8216; エキスパート アドバイス &#8217; 測定中にデータの品質に関するフィードバックのタブ</li>。
		測定が完了したら、<li>は分散インデックス値が 0.3 未満であることを再確認します。キュムラント適合データ ポイントに密接にライン次のようであることを確認してください、&#8216; フィット キュムラント &#8217;] タブ</li>
	</ol></li> <li>各サンプルの粒度として測定ごとに報告された Z 平均粒子径の平均を取る。プロットの温度 ° C 対 nm の直径</li>
</ol> 4。リアルタイムで検出ウイルス集計の DLS 注: 以下の手順ソフトウェアにある可能性があります、楽器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用されます。
<ol><li>DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 目的、平衡時間として 0 秒、電池の種類を = = 石英キュベット測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間 = 自動、測定の数 = 50 (増加又は減少によって凝集率があります)、測定間の遅延 = 0 秒、データ処理: 解析モデル複数の狭いモード (高解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します</li>。
	<li>を開き、新しいサンプルの名前をソフトウェア内で実行の矢印を選択でき、温度平衡に到達する計器</li>。
	<li>濃度 5 μ G/ml と 200-500 μ L 間ボリュームで微量遠心チューブに 1x PBS で、群集を中断渦停止します</li>。
	<li>スピン ・ ダウン解消ガス卓上遠心分離機で 5-10 s 用 VLP ペンション。サイズの測定と干渉する熱処理中に気泡を防ぐことができます</li>。
	<li>転送 VLP サスペンションが少量の石英キュベットは、泡を避けるため、キュヴェットの壁にゆっくりピペットします。計測器は、温度平衡に達した、キュヴェット試料室に挿入します</li>。
	サンプル温度平衡に <li>を待つ 10 秒は、実行を開始します。実行の開始時にタイマーを開始します。最初の測定の最後にタイマーを停止します。最初の時点として、この時間を取る。ソフトウェアによって記録された測定時間から後にポイントを取得します</li>。
	<li>、実行を開始し、コレログラム、フィット、配布、データの品質を評価するための専門家のアドバイスを監視します 。
	注: PDI が必ずしもサンプルとしてこれらの測定値の 0.3 未満は集計中多をする予定です。
	<ol><li>相関係数は定数と、閉じるは短時間で 1 以上と 1 つまたは複数の後の時代、粒子の粒径特性でが激減していることを確認します</li>。
		<li>分布適合データ ポイントを密接にラインの次を確認してください</li>。
	</ol></li> <li>サイズ データを分析します。
	各計測と初期時点の時間の違いから <ol><li>を決定するたびにポイント。測定期間は、まったく同じではありません</li>。
		<li>強度分布を使用して記録計測/時間の各ポイントの最大領域とピークのサイズ</li>。
		<li>対分時間 nm のピークの直径をプロット</li>
	</ol></li></ol> 5。TEM のサンプル準備 TEM 用に設計された <ol><li>取得カーボン サポート フィルム (ニッケル) グリッド 。
	注: 相談施設顕微鏡で推奨される試薬および使用のために処理の中核施設。乾燥や湿気への露出を最小限に抑えるための真空チャンバーを含むボックスのグリッドを保存してください</li>。
	<li>は、フィルター ペーパーの約 5 cm × 5 cm 部分を引き裂きます。ガラス シャーレを取得し、適切な自己終了逆ピンセット顕微鏡で使用するために設計されています</li>。
	<li>は、パラフィン膜の約 2.5 cm × 5 cm 部分をカットします。ベンチトップ場所</li>。
	<li>ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理 <ol><li>1.1.1 - 1.1.5 以外の手順で説明したとおりに熱処理の手順に従います: PBS ではなく治療のため 10 mM HEPES (pH 7.4) を使用し、カプシドを更に希釈していません。(50 μ G/ml に維持液) の治療後。ピペットのパラフィン フィルム上に扱われたキャプシド ソリューションの全体 ~ 15 μ L ドロップします</li>。
	</ol></li> <li>グリッドを保持するために端に閉じることができますピンセットでグリッド エッジをつかむし、グリッド炭素側-ダウン処理溶液の一滴の上に配置します。グリッドにアタッチするカプシドを許可する 10 分間インキュベートみましょう。
	<ol><li>キャプシド準備の純度によって扱われたキャプシド液滴後線に置く 10-15 μ L 液滴の形で必要な場合に 10 mM HEPES ソリューションの洗浄を追加します</li>。
		<li>後 10 分は、液滴とグリッドを拾います。液滴を離れて放出するろ紙の部分にほぼ垂直グリッドを配置します。グリッドに 10-15 μ L HEPES 緩衝液の液滴をピックアップ、フィルター紙ワシントン州の別の部分で 30 秒、その後、芯先の保持</li>
	</ol></li> <li>空の領域でのパラフィン映画のウラニル 2% 酢酸溶液の 15 μ L の液滴を配置。
	<ol><li>グリッドと酢酸ウランの液滴をピックアップし、保持 45 s. 芯先の酢酸ウラン、ソリューションの大部分を削除することを確認されています。グリッド炭素側にグリッドがしないように注意しながら、フィルター紙の &#34; スティック &#34; ピンセットで湿気に。オープン ガラス シャーレに濾紙グリッドを配置します 。
		注: は、グリッドはそれらに静電気的に引き付けられる、立ち往生になるプラスチック シャーレを使用しないでください皿にします</li>。
	</ol></li> <li>すべての治療を繰り返します。Tem 観察の前に乾燥して一晩乾燥器で、グリッドを使用してシャーレ半分を配置します</li>。
	<li>相談顕微鏡施設それぞれの施設で準備されたグリッドの観測について。いくつかの施設の設備の操作に関するトレーニングを受けるユーザーに許可 &#39; 秒計測器。セットアップおよび特定の顕微鏡の観察に関する詳細は beyond この資料のスコープします</li>。
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destruction+of+the+Capsid+and+Genome+of+GII.4+Human+Norovirus+Occurs+during+Exposure+to+Metal+Alloys+Containing+Copper.">Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).</li><li>Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+murine+norovirus+on+a+range+of+copper+alloy+surfaces+is+accompanied+by+loss+of+capsid+integrity.">Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2014).</li><li>Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+disinfectant+containing+silver+dihydrogen+citrate+against+GI.6+and+GII.4+human+norovirus.">Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus.</a> J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+human+norovirus+using+chemical+sanitizers.">Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers.</a> Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).</li><li>Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+Tulane+virus,+a+novel+surrogate+for+the+human+norovirus.">Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus.</a> J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).</li><li>Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+studies+on+binding-based+RT-PCR+detection+of+infectious+noroviruses.">Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses.</a> J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).</li></ol>

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プロトコルとここで説明する手法は、人間ノロウイルス キャプシドの整合性/機能を評価する手段を提供します。これらのメソッドは、機械論的洞察、ウイルスに対する不活性化処理の効果を得るため使用することができ、Rt-qpcr またはプラーク アッセイなどのより伝統的な不活化評価方法を補うことができる可能性があります。たとえば、ウイルスの不活性化の程度のその不活性化の基に?...

ヒトのノロウイルスはかなり保健負担を担当、世界的に約 6 億 8500 万病気や 212,000 人が死亡の原因と毎年1ドル2,3の十億の費用で。今日では、ノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅および/またはリガンド ベースのプラットフォームが含まれます。前者は、量的な情報はより敏感、偽陽性の結果4のリスクが低く、一般に好ましい。最も一般的なノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅技術は、逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) です。対象人間ノロウイルスのゲノムの小さなセグメントを増幅するので、RT qPCR だけでは感染を区別できないと非感染性粒子、無料のゲノム RNA として破損しているゲノムを含むカプシド、カプシドと致命的なゲノムの変異切り捨てはまだ Rt-qpcr によって増幅することができます。両方はまだウイルス定量 RT qPCR に依存し、まだ日常臨床・環境の可能なメソッドではありません 2 つ新しい体外栽培技術人間ノロウイルス5,6は、最近報告されているが、ヒトのノロウイルスをテストします。従って、RT qPCR 残る臨床・環境をテストするためのゴールド スタンダードです。
その他の培養方法は、ノロウイルス粒子の感染状態を適切に推定するために開発されています。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性をアドレスとゲノムの評価として一般に分類できます。前者のアプローチはより普及しました。これは致命的な変異があるウイルス粒子と同様、ウイルスの粒子はそのまま残りますが、宿主受容体/co-因子をバインドする機能がないため考慮しませんしかし、一般的に使用されるメソッドはウイルスのゲノム RNA の抽出前に RNase 前処理または切り捨てたりゲノム7をわずかに破損しています。人間ノロウイルス co-receptor/共同因子、炭水化物であるにバインドする、ウイルスの能力に基づいて、キャプシドの整合性を評価できる病理組織血液型抗原 (HBGAs) として知られています。HBGAs 糖タンパク質や糖脂質 (他の複数の組織) の中の一部として宿主の腸管上皮細胞に存在し唾液のような体液の分泌があります。その表面上 HBGA 様物質を含む腸内細菌は、ヒトのノロウイルス8,9,10をバインドする示されているし、このような相互作用は、ノロウイルス感染症5を促進する可能性が。HBGA バインディングを活用の基本概念は、ウイルス粒子のみ、推定受容体/共同-factor をバインドできる細胞を感染させることができることです。複数の研究が核酸増幅の前ビーズ ベース HBGA バインディングが感染性差別11,12,13,14のための有望な方法であることを示唆しています。 15,16。HBGAs に関する主要な課題は、人間ノロウイルス遺伝子型のすべてをバインドできます単一 HBGA 型がないことです。これに対処するため HBGAs が含まれている、豚の胃粘液は、合成、一貫性、およびコスト削減の容易さの利益のための浄化された HBGA 炭水化物の代わりに使用されています。
ムーアらによって最近の出版17は、ヒトのノロウイルス キャプシド整合性を推定するための新しい技術のセットを導入しました。HBGAs、ムーアらの代わりに17広く反応性核酸アプタマー (M6-2)18 , 広く反応性モノクローナル抗体 (NS14)19熱処理 GII.4 シドニー ノロウイルス カプシド (ウイルス様粒子または群集) のバインドを調査し、これを比較して合成 HBGAs にバインドします。核酸アプタマーは、短い (20 ~ 80 nt) 単一鎖核酸 (一本鎖 Dna または RNA) それらの順序の結果としてユニークな立体構造に折るし、ターゲットをバインドします。核酸があり、彼らはより少なく高価です。簡単に化学的に合成、精製、および変更された;熱に安定しています。アプタマー ノロウイルスに対して生成のいくつかのレポートが存在するそれらのいくつかのさまざまな系統18,20,21,22に広範な反応性を示します。一例として、ムーアら17アプタマー M6 2 精製、組み立てられた人間ノロウイルス カプシド (群集) にバインドされのより高い順序 (例えば、二次、三次) タンパク質の構造を維持するためにウイルスのキャプシド依存 HBGA にも同様の振る舞いを示した発生するバインディング。その一方で、抗体にノロウイルス VLP バインディングのかなりの割合 NS14 は残った完全に変性させるとカプシド後です。ムーアらによる研究ではノロウイルスのバインディングの評価17が行われた elisa 法のような単純なプレート ベース メソッドを用いたアプタマーは抗体の代わりに使用する例外 (したがってメソッドが ELASA 呼び出された)。この高スループット実験法は、ノロウイルス カプシド、物理的または化学的ストレッサーへの露出にウイルス不活化の機構を理解する上で貴重な作品でさまざまな治療法の効果を評価する使用されました。ただし、このメソッドに欠点は、低感度とアプタマーによる非特異的結合を引き起こす可能性より高いレベルでの汚染物質のマトリックス関連の寛容の欠如です。
ムーアら17は、熱処理への応答でウイルス粒子の集合を監視するのに別の方法、動的光散乱法 (DLS) を使用しました。DLS は、ナノ粒子懸濁液のサイズを評価する使用され、蛋白質23,24やウイルス25,26,27に拡張されています。溶液中の粒子からの散乱光の強度は拡散係数と、確立された式を使用して粒径の計算を可能にする粒子の大きさの関数として変動します。DL 法は、サイズ27に基づいたウイルス集計や二量体、個々 のキャプシド分散されたウイルスの検出を可能にするナノスケールまで分散粒子の流体力学的直径を区別できます。粒子サイズの増加によって表される、ウイルスの集計はキャプシドの整合性の損失を表しています。カプシドの変性しその構造の破壊、疎水性残基さらされる、一緒にスティックし、集合体を形成する粒子を引き起こします。DLS は、指定した処理やリアルタイム17,28の集計速度後粒子サイズを測定する使用できます。このメソッド ソリューションのキャプシド挙動の観察を許可する利点がある完全自然の状態でウイルスを代表することができない精製キャプシドの高濃度が必要です。
ムーアらによって利用される最後の方法17は、透過型電子顕微鏡 (TEM) だった。このメソッドは、感度を欠いている、定量的データを生成しません、ウイルスのカプシド構造のさまざまな治療法の効果の可視化が可能です。まだ臨床/環境設定の理想的な組み合わせでこれらのメソッドの使用は人間のノロウイルス不活性化を理解する上で貴重です。プレート ベースの結合の試金 (ELASA)、DL の詳細なプロトコルを提供するこの記事の目的は、TEM の準備メソッドを使用してキャプシドに治療の及ぼす影響のコンテキストでノロウイルス キャプシドに及ぼす熱処理の効果を調査整合性・ ムーアらに提示されています。17。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well, medium-binding polystyrene EIA plate</td><td>Fisher (Costar)</td><td>07-200-36</td><td></td></tr><tr><td>Lid for 96-well plate</td><td>Thermo Fisher</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film (Parafilm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.2)</td><td>Life Technologies</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Individual 0.2 ml PCR tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-154G</td><td></td></tr><tr><td>2 thermocyclers</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop mini centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk solids</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031B</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated</td><td>Glycotech</td><td>01-017</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 &amp;micro;M in nuclease-free water): 5&#039;-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004</td><td>Life Technologies</td><td>SNN2004</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;,5,5&amp;rsquo;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>1 M phosphoric acid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader capable of reading 450 nm</td><td>Tecan</td><td>Infinite m200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Analysis of Plate-Based Assay Results&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel or similar program</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dynamic Light Scattering Experiments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientifc</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Quartz cuvette</td><td>Hellma</td><td>104-002-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transmission Electron Microscopy Sample Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel electron microscopy grids with carbon support film</td><td>Ladd Research</td><td>10880-100</td><td></td></tr><tr><td>Self-closing reverse electron microscopy tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>5372-NM</td><td></td></tr><tr><td>Qualitative filter paper</td><td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td><td>WHA1002055</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455743</td><td></td></tr><tr><td>100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2% uranyl acetate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

alternative in vitro methods for the determination of viral capsid structural integrity

ヒトのノロウイルスは、かなりの公衆衛生と世界的な経済損失を強要します。体外新興栽培の進歩はまだ適用されませんルーチン検出ウイルスのためです。電流検出と定量化技術は、核酸増幅に主に依存している差別しない非感染性のウイルス粒子の感染。この資料の目的は、さらにウイルス粒子の感染状況に関する情報を取得するために一緒に使用される技術の最近の進歩に関する特定の詳細を提示することです。1 つの技法は、カプシドにノロウイルス一本鎖 Dna アプタマーの結合を評価します。簡単に合成し、変更されているという利点がある、アプタマーとは、安価で安定しました。別の手法、動的光散乱 (DL)、ソリューションにおけるキャプシド挙動を観察することの利点があります。電子顕微鏡によるウイルスのカプシドの構造の整合性の可視化が可能です。有望なが非特異的アプタマーへのバインディングなど荷電分子サンプル マトリックスから dl、精製キャプシドの要件と感度不良電子顕微鏡検査のためのそれぞれの手法のいくつかの欠点があります。それにもかかわらず、これらの技術を組み合わせて使用する場合生成データの体について説明しますより包括的な感染性の正確な評価のために不可欠である情報を推論するためノロウイルス キャプシドの整合性不活化メソッドまたはウイルスの検出の解釈。この資料では、感染のヒトのノロウイルス粒子を識別するこれらのメソッドを使用してプロトコルを説明します。

人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシド (群集) の構造の整合性は、ムーアらによって表されるいくつかの手法を使用して評価されました。17。 で実験が最初に行われていたと推定される受容体/共同-factor (HBGA) を一本鎖 Dna アプタマー (M6-2) を結合する機能の機能として、カプシドの整合性であった (図 1) を比較。表示?...

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Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー バインディング、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた感染症ノロウイルス粒子の識別を支援する別の方法について詳細なプロトコルを提供することです。

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

8.0K ビュー.  North Carolina State University. ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー バインディング、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた感染症ノロウイルス粒子の識別を支援する別の方法について詳細なプロトコルを提供することです。

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

免疫・感染学

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

生物工学

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

要約

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ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

要約

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ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製