多細胞組織複合体は、このプロトコルは、細胞伝導を単純化して再構成する。一つは、細胞伝導体陽子と細胞応答との直接関係を研究するこの技術です。このプロトコルは、化学的に機能性のポリスチレンビーズを使用して、細胞伝導体陽子を再構成します。
ビーズは、細胞応答への影響をテストするために、関心のある任意の陽子で切断することができます。我々は、マウス胚にC-エレガンスでこの方法を使用しています。したがって、このプロトコルは、広い生物の研究に直立することができます。
胚は高い完全な亜塩素酸塩処理の後に壊れやすいので、ブラストミアを正常に単離するには重要な練習が必要です。視覚的なデモンストレーションは、ブラストミア分離法の間に毛細血管をどのように扱うべきかについて、より深く理解を提供する。まず、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにカルボキシレート変性ポリスチレンビーズの10ミリグラムの重量を量る。
チューブに1ミリリットルのMESバッファーを加え、洗浄します。ビーズを混合するためにチューブをボルテックス。ベンチトップ遠心分離機を介して2000XGで60秒間チューブを回転させます。
慎重にバッファーをピペットアウトすることにより上清をディカード。MESバッファーの1ミリリットルで再びビーズを洗います。洗浄後、10ミリグラムのEDACを含むMESバッファーを1ミリリットルのMESバッファーをチューブに加え、表面カルボキシル基を活性化する。
ビーズを混合するためにチューブをボルテックス。室温で15分間チューブを回転させてインキュベートします。2000XGで60秒間ビーズをスピンダウンします。
慎重にバッファーをピペットアウトして上清を捨て、PBSの1ミリリットルで洗浄します。チューブをボルテックスしてビーズを混合し、PBSをもう一度洗浄する。0.65ミリリットルローダミンレッドXストック溶液から1ミリリットル、10、100、ローダミンレッド-Xの1000倍希釈シリーズを準備します。
ピプレット 20 マイクロリットルのビーズを各シリアル希釈管に入れる。室温で5分間チューブを回転させてインキュベートします。1ミリリットルのPBSでビーズを2回洗います。
洗浄後、チューブにPBSを1ミリリットル加え、摂氏4度で最大6週間保管します。ライブイメージングに使用する顕微鏡でビーズの蛍光強度を確認します。マイクロキャピラリーの両端を右手と左手で10マイクロリットルの容量で保持します。
両端にマイクロキャピラリーを引っ張って張力を加え、バーナーの上に毛細血管の中心を持って2つの手で引っ張られた毛細血管を作ります。解剖顕微鏡の下で、鉗子で手で引っ張られた毛細血管の先端をトリミングする。2つの先端の開口サイズを約2回、胚移植と卵殻除去のためのC-エレガンス胚の短いアクセス長の1倍にします。
引っ張られた毛細管を口のピペット装置に取り付けます。ピプペット45マイクロリットルの卵塩溶液を多ウェルスライドの井戸に。5~10人の大人のCエレガンスを井戸の上に置きます。
初期のC-エレガンス胚を得るために、Cエレガンスの体の左右に2本の針を配置し、針を互いに滑らせて、大人を粉々に切った。ピプペット45マイクロリットルの次亜塩素酸溶液は、その後の3つのウェルにシェルトンの成長培地の卵塩溶液とピプペット45マイクロリットルを含む井戸の隣の井戸に。1つの細胞段階および初期の2つの細胞段階胚を、より大きなサイズの開口部を有する口ピプペットによって次亜塩素酸溶液に移し、40〜55秒間待つ。
シェルトンの成長培地で次の3つの井戸に移して胚を洗います。最初の2つの井戸のそれぞれで1〜2秒で。小さなサイズの開口部を持つ手描きの毛細管を使用して、卵殻除去のために胚を慎重にピペット化を繰り返します。
その後、手描きの毛細管を持つピペットを連続的にピペットして、2細胞段階の胚性芽胚形を分離する。卵殻除去後、破裂を防ぐために胚を上下にピペットする力を最小限に抑えます。カバースリップをカバースリップホルダーに置いてイメージングチャンバーを準備し、カバースリップの端をテープでテープで貼ってスタバリゼーションします。
カバースリップホルダーをめくり、疎水性ペンでカバースリップに円を描きます。疎水性マーカーによって描かれた円の中にシェルトンの成長培地を加え、円内のイメージングチャンバーに分離されたブラストミアを移します。さて、より大きな開口部を持つ手描きの毛細管を使用して、化学機能化されたビーズの少量をカバースリップに分配します。
ビーズが分離したブラストミアに付着するまで手描きの毛細管に吹き込んでビーズの位置をコントロールします。カバースリップを取り付けて、媒体の蒸発を避け、逆顕微鏡を使用してライブイメージングを行います。本研究では、GFPミオシン-2およびM-チェリヒストンを発現するトランスジェニック株に対して、0.005マイクログラム/ミリリットルローダミンレッドXスクシニミジルエステルで処理されたビーズからの蛍光シグナルが弱すぎた。
一方、1ミリリットルローダミンレッドXスクシニミジルエステル当たり5マイクログラムで処理されたビーズからの蛍光シグナルは強すぎました。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムでのローダミンレッド-Xスクシニミジルエステルの濃度は、この特定のトランスジェニック株に最適でした.ライブイメージング中に、2つのセントロソームが垂直に整列している場所が特定されました。
この平面のプラスまたはマイナス90度の角度を持つ平面はスピンドル平面です。サイトカネシス後の細胞/ビーズ接触インタフェースに対するスピンドル方向の角度は、両方の接触点を通過するラインで両方の娘細胞がビーズに取り付けられたことを示し、接触方向として使用した。口のピペットによって適用される特定の外力に対する胚と卵殻の反応を学ぶ必要があります。
理論的には、任意の細胞応答を研究することができ、例えば、硫酸塩の指定は、より長い用語にわたって細胞および接着ビーズとの接触を培養することによって研究することができる。この手法は、接触依存セル分割方向機構を理解するために使用されています。PTFフィルターは、口内ピペットを介して次亜塩素酸溶液の煙の吸入を防ぐために使用された。
