このプロトコルは、生きた胚の細胞系素子とアイデンティティの効率的なトレースを可能にする一方で、C.elegansニューロンの発達における軸索や樹状突起などの詳細な細胞形態を同時に分析する。共焦点顕微鏡と比較して、デュアルビュー反転選択的平面照明顕微鏡またはdiSPIMは、ノイズに対するより高い信号、より等方性の空間分解能を提供し、長期的なインビボイメージングに適しています。凹型顕微鏡スライドのうつ病に1%メチルセルロース溶液の500マイクロリットルを加えることで始めます。
プラチナワイヤーピックを使用して、線虫増殖培地プレートからM9メチルセルロース溶液に成人を移す。18ゲージの皮下注射針の鋭利な先端を使用して、各動物を中身で横方向にスライスし、少なくとも1〜4個の細胞胚にスライスします。歯の間にそっと保持された吸引マウスピースで、マイクロキャピラリーピペットに10〜15マイクロリットルのM9バッファーをプレフィルし、スライドから毛細血管に複数の胚を穏やかに吸引します。
新鮮なM9バッファーで満たされたスチールイメージングチャンバーのカバースリップの中央の長方形に胚を分配します。各胚の長い軸がカバースリップの長い軸に垂直になるように、胚を垂直方向にそっと向けます。次に、スチールイメージングチャンバをdiSPIMのステージ上のサンプルホルダーに配置します。
イメージング用の胚を準備するには、マイクロマネージャーを開き、488ナノメートルの場合は179マイクロワット0.5%の同等値にレーザー強度を設定し、561ナノメートルの場合は79マイクロワット0.25%同等値に設定します。ソフトウェア調整と真のレーザー出力の間の校正は、特定のマイクロワットの範囲を設定するために、事前に行う必要があります。プラグインメニューで、デバイス制御を選択し、科学画像diSPIMを適用し、適用された科学イメージングデュアルビューの二重ビューの選択的平面照明顕微鏡ウィンドウを開きます。
取得タブで、パラメータが示すように設定されていることを確認します。オートフォーカスタブで、示されているとおりにパラメータを設定します。オートフォーカスチャネルは、計画的な系統化実験に対して核蛍光チャネルを指定する必要があります。
ビームとシートボックスのパス A または B をチェックし、ライブをクリックして画像の取得を開始します。ライブビューウィンドウが開きます。次に、対象となる胚の周りにボックスを描いて胚の自動焦点解析領域を選択し、取得開始をクリックして、長期的な多次元画像キャプチャを開始します。
画像表示、処理、および細胞系の分析のために、ソフトウェアバンドルをダウンロードして解凍した後、CytoSHOW_app.jnlp ファイルをダブルクリックして CytoSHOW の実行を開始します。ファイル メニューで、新規および diSPIM モニタ マイクロ マネージャーを選択して、raw マイクロ マネージャー イメージが保存されたルート データ セット フォルダを見つけます。
任意のタイムポイントフォルダを選択し、[開く]をクリックします。多次元ナビゲーションウィンドウは、SPIM AとSPIM Bの両方で自動的に開かれます。ポリゴン選択ツールを使用して、対象となる胚の前部、後部、後部、腹側、腹側のエッジのすぐ外側をクリックして、SPIM AとSPIM Bビューの両方で胚の上に蝶ネクタイパターンを生成し、diSPIMをクリックします。各 SPIM アームの緑と赤のチャネルを調整し、もう一度 diSPIM をクリックします。
シフトは、他のすべての位置ウィンドウでトリガーされます。次に、diSPIM をクリックしてヒューズを押してデコンボルブヒューズ diSPIM 生データ ボリューム ダイアログ ボックスを開き、示されているとおりにパラメータを設定します。すべてのパラメータが設定されたら、[はい]をクリックし、処理されたファイルを保存する出力ディレクトリを指定してから[OK]をクリックします。プレビュー ウィンドウで、t-scroll バーをウィンドウのタイム ポイント 2 に移動し、ビューが胚の長い軸に直接表示されるまで Z スライダを移動します。
t-scroll バーをプレビュー ウィンドウのタイム ポイント 1 に戻し、線選択ツールを使用して、腹側の最も円形の核から AB 細胞メタフェーズ プレートの平面を通る線を描画します。diSPIM プレビュー ボタンをクリックして、プレビューされたイメージボリュームの向きに微調整を保存します。diSPIM モニター・ウィンドウの t-scroll バーを、処理するイメージの全スパンの開始および終了のタイム・ポイントに設定します。
次に、[OK] をクリックします。効率的で正確な細胞系統解析のためには、スターリーナイト処理の前にデータ量の正確なADL方向を達成することが重要です。AceTree で Starry Night 系列トレース シリーズを開くには、提供されたカスタマイズされた AceTree ファイルを開き、オープン構成ファイルを選択して、前に示した出力ディレクトリを見つけます。対象となる胚のヒューズサブフォルダを開き、編集したファイルを選択します。
次に、[開く] をクリックし、前述のように、系統の視覚化と編集に進みます。最適化されたプロトコルは、孵化の時間と発達のマイルストーンに関連するタイミングによって評価される胚に検出可能な光毒性を誘発しない。このプロトコルを用いて実証したように、この線虫株を発現するトランスジェニック緑色蛍光タンパク質における未確認細胞は、運動ニューロン、排泄管細胞、及び2つの筋細胞に対応すると判断した。
同定されたニューロンは、受精後360分で斜めに形を整え、後の神経突起成長の軸を表す長い細胞軸を有する。RMDD神経突起は、受精後385分から410分まで、細胞体の約6マイクロメートル前部を拡張した。受精後415分から445分まで、両方の神経突起は推定神経環の前後に背もたって伸びた。
平均して、各RMDDニューライトは、リングの頂点で対側の相手を同期的に満たす前に、細胞体から約11マイクロメートルを拡張した。これらのデータを組み合わせることで、単一の識別可能な細胞の神経発達機能を、この統合プロトコルを使用して調べ、比較し、定量化できることを実証する。各胚の長い軸がカバースリップの長い軸に垂直になるように、胚を垂直に向けることを忘れないでください。
このプロトコルを用いて、あらゆる角度から新生胚性神経系を探求し始めました。例えば、細胞の誕生、移動および分化、神経突起形成、成長および魅惑の間に。
