クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1 1。素材のセットアップ<ol><li>細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播種。これらのプレートに用いられるペプトンの量は、通常、NGMプレートのために使用される8倍の量である。高いペプトン濃度が厚い層に成長するためにどの反しOP50-、より効率的NA22細菌の成長を支える。 </li></ol> 8Pプレートレシピ： 3グラムのNaCl物、20gバクト - ペプトン、30分間の滅菌蒸留水を、オートクレーブ1L中25gの寒天を溶解する。 MgCl 2を 55℃で培地が冷えて、次にコレステロールの滅菌濾過した1ミリリットル（EtOH中5ミリグラム/ ml）を追加し、1の1ミリリットル、MgSO 4を1mlの緩衝液およびKP（500ミリリットルのストック：5gのK 2 HPO 4、30gのKH 2 PO 4、pHは6.00）を25ml。 10センチメートルペトリ皿（25ミリリットル/プレート）内に液体寒天培地を注ぐ。 <ol start="2"><li>翌日、NA22 E. 1mlの各富化ペプトン寒天プレートの表面全体に広がる2XYTメディア（16グラムトリプトン、10gの酵母エキス、滅菌水、pH7.0の1L中に5グラムのNaCl）、37℃で一晩培養した大腸菌中これらの細菌は妊娠成人の大量増殖を支持する厚い層を形成する豊富な食物源を構成している。細菌の増殖を可能にするために、室温で一晩播種したプレートを残す。プロセスは4-5時間37℃でインキュベートすることによって加速することができる。 </li><li>播種8Pプレートに飢えた動物を転送します。 5-6 M9バッファーまたはmlの水を使用して飢えNGMプレートを動物に洗い落とし、各8Pプレートにこの懸濁液1〜2 mLを加え。 </li><li>動物の成長および増殖をUNT許すILプレートは妊娠大人合流点に移入されます。 </li><li> Cの調製に必要な卵を隔離溶解溶液5-6ミリリットル用い妊娠成人からの胚細胞を、 エレガンス 。 </li></ol>溶解液のレシピ新鮮なブリーチの5ミリリットル、10 N NaOHを1.25ミリリットル及び滅菌H 2 Oの18.5ミリリットルこの混合物は、それぞれを使用する前に新たに調製しなければならない。 <ol start="6"><li>卵の緩衝液を使用して妊娠成人から分離された卵を洗う。 </li></ol>卵バッファレシピ 118のNaCl、48のKCl、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、25mMのHepes、pH7.3の、オスモル濃度340ミリオスモル。 <ol start="7"><li>キチナーゼで処理することにより、卵を取り囲んで卵殻を削除します。キチナーゼは酸性pH 25で最大活性を有する酵素である。 2 mg / mlの最終濃度卵緩衝液pH6.5中キチナーゼ（Sigma社、カタログ番号C6137）を溶解する。キチナーゼの在庫を保管無菌15ミリリットル中に1ミリリットルのアリコートで-20℃円錐管での解。アリコートを数ヶ月まで、-20℃までで保存することができる。 </li><li> Cを育てるピーナッツレクチンで覆われてオートクレーブしたカバーガラス（直径12mm）上の線虫の培養細胞。滅菌水（0.5 mg / ml）を中にピーナッツレクチンを溶かす。ピーナッツレクチン溶液を濾過またはオートクレーブ処理してはならない。また、UV光で処理する必要がない。最長6ヶ月間-20℃で保存2ミリリットルのアリコート。 </li><li>完全な細胞培養培地（500ml）をGibco社50mlのウシ胎児血清（熱不活化）、7.7グラムのスクロース（45ミリオスモル）、100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ml5mlの/から500ミリリットルL-15培地を含有するストレプトマイシン（2％）。完全培地を、次いで、0.20μmのポアフィルターを用いて濾過する。 </li></ol>卵液と培養液をそれぞれ340の浸透圧および345 mOsmであることに注意してください。実際に、哺乳動物細胞に反して、C.虫細胞が比較的高い浸透圧を持っているそれは、細胞の原形質膜と直接接触するソリューションを調製する場合、カウントに入れる必要がある。これらの試薬 ​​のレシピは1浸透圧計を用いて測定した所望の容量オスモル濃度に達するように調整した。なお、これらのレシピは正確に従っているとの注意をこれらの試薬を調製する際に使用される場合、浸透圧計を使用する必要はない。他のソリューションは、そのレシピここで報告されていないか、またはCを使用するパブリケーションのいずれかで、準備する必要がある場合は、1がosmoterを使用する必要があります培養細胞エレガンス 。 2。卵の分離<ol><li>これは、（24ウェルプレート）で培養した細胞の12ウェルについて十分な卵を収集するために、少なくとも4 8Pプレートで始めることをお勧めします。 </li><li>手順を開始する前にピーナッツレクチン原液の1のチューブを解凍する。 24ウェルプレートのウェルの底にオートクレーブしたカバーガラスを置き、カバーグラスにピーナツレクチンを200μlを加える。 1時間またはuインキュベート細胞ntilめっきされる準備ができている。完全にピーナッツレクチンを削除し、滅菌オートクレーブ処理水1mlで一度井戸を洗浄します。カバースリップからピーナッツレクチンの完全な除去は、細胞凝集を避けるために不可欠である。 </li><li>無菌オートクレーブ処理水を用いた寒天平板から妊娠成人を洗ってください。 2の滅菌コニカル50ミリリットルチューブにサスペンションを収集します。チューブ（*）の一番下にあるワームの沈殿を可能にするために、最大5分間氷上でチューブを残す。転送プラスチックピペットを用いて水を除去し、新しい滅菌オートクレーブした水と交換してください。 10分（*）のための200 XG（〜1,200 rpm）で卓上型遠心分離によってペレットワーム。少なくとも3この最後の手順を繰り返します。 </li><li>無菌15ミリリットルコニカルチューブにワームを転送し、200×gで10分間（〜1,200 RPM）（*）でそれらをペレット化。だけでなく、チューブの底に菌を収集避けるために、より高い遠心分離速度を使用しないでください。時々、遠心分離後にワームが完全にペレット化されていません。 AFTERは、各洗浄·除去する前に上清を、氷上で5分間チューブを配置します。冷水ワームズチューブの底に沈殿する。 </li><li>水を除去し、溶解液5-6 mLを加え（素材のセットアップを参照してください）​​。 5〜10分間静かにサスペンションロックしてから2〜3分ごとに実体顕微鏡下でワームの溶解の監視を開始。懸濁液を一滴も容易に検査のためにカバースリップ上に配置することができる。インキュベーション時間は、漂白剤の鮮度が異なることもあり、漂白剤の小瓶を購入し、毎月新しいボトルを開きます。 </li><li> 〜ワームの70〜80％が（インキュベーションの開始から10分）を溶解している場合、（素材のセットアップを参照）卵液pH 7.3の9ミリリットルを追加することにより、溶解反応を停止させる。 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で懸濁物を遠心分離する。この時点で、オンから卵（*）の再汚染を防止するためにベンチに、上のブンゼンバーナーを有する。 </li><li>注意深く滅菌プラスチックトランスファーピペットを用いて上清を除去し、ペレットを洗浄3-4卵のバッファーでX溶液が透明になるまで。各洗浄中に卵のバッファにペレットをよく混ぜにしてください。 </li><li>卵を30％ショ糖溶液を用いて動物の死体から分離される。無菌卵液2mlにペレットを再懸濁し、60％ショ糖溶液（無菌卵バッファの株式）の2ミリリットルを追加します。よく混ぜると200 XG（〜1,200 RPM）（*）で20分間遠心する。 </li><li>慎重に遠心機からチューブを取り外します。卵は、溶液の上部に浮遊している。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブにすべての卵を移す。 </li><li> 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で遠心チューブに無菌卵緩衝液10mlを追加します。洗浄を3×を繰り返します。卵は完全に洗浄中に卵の緩衝液に再懸濁していることを確認します。 </li></ol> 3。胚細胞解離層流フードを使用して無菌条件下で手順の次のステップを行っています。動物がいる間細菌プレート上でガウン、漂白剤を含む溶解液で洗浄および治療がないがほとんどすべての細菌を排除する必要があります。したがって手順のこの時点で層流フードを使用して卵懸濁液の新たな汚染を防止する。 <ol><li>再懸濁は、2 mg / mlのキチナーゼ（卵液pH 6.5（*）の株式）の1ミリリットル中に卵をペレット化し、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブに転送。室温で10から30分間、チューブを揺する。正確なインキュベーション時間は、酵素と部屋の温度の鮮度に応じて変化するので、それぞれの調製物について決定されるべきである。これは、インキュベーションの10分後に反転し、細胞培養、顕微鏡下で卵の監視を開始することをお勧めします。注意：我々の経験では、低pHはキチナーゼ酵素活性を増加させる。このような理由から、我々はキチナーゼ（pHはNaOHを用いて6.5​​に調整した上で報告されたレシピを、）を溶解するためにpH6.5で卵のバッファを使用しています。 </li><li> 〜卵の殻の80％はで消化されるとキチナーゼ処理（ 図1-B）は 、900×gで3分間（〜2,500 RPM）（*）で遠心分離して卵をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、慎重に上清を除去し、L-15培地（*）の3ミリリットルを追加します。 </li><li>直径6cmプレートに卵を移し、ゆっくりと18 Gの針を装備した10ミリリットルの無菌注射器を用いて細胞を解離する。新鮮なプラスチック製のシャーレにサスペンションのドロップを配置することにより、顕微鏡下で表示することにより、解離度を監視します。細胞の損傷を防ぐために、この手順の間、注射器内に空気を吸引しないでください。細胞の80％が解離して〜まで解離を継続する。 </li><li>滅菌5μmのミリポアフィルターを用いて懸濁液をろ過する。細胞懸濁液は、細胞凝集塊、未消化の卵と孵化した幼虫を除去するためにフィルタリングされなければならない。すべての細胞を回収するためにフィルタを介して新鮮なL-15メディアのさらに4〜5ミリリットルフィルター。 DAを避けるために、濾過工程の間に無理な力を加えないでください。フィルタおよび/または細胞をmaging。 </li></ol> 4。細胞を培養<ol><li> 3分（*）のために900 XG（〜2,500 rpm）で遠心分離により分離した細胞をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用すると、慎重にすべての上清を除去します。完全なL-15培地とプレート1ミリリットル/ウェルでペレット化した細胞を再懸濁します。添加培地の使用量は、8Pプレートの数、プレート上のワームの合流点、および細胞上で行われる実験の種類に依存する。細胞密度を、血球計数器を用いて決定することができる。 〜23万細胞の密度でプレーティングパッチクランプ記録のために個/ cm 2が最適である。 </li><li>培地の蒸発を回避するために、湿ったペーパータオルを含むプラスチックタッパーウェア容器に24ウェルプレートを保持する。 20℃、周囲の空気の加湿インキュベーターで容器を保管してください。 </li><li>際形態的分化と発現する細胞は、24時間以内に通常の実験のための準備ができているGFPマーカーのイオンが完了している。細胞は、最大2週間培養中に保持することができるが、それらは播種後、通常7〜9日までの最も健康である。媒体は、健康な細胞を維持するために一日一回交換する必要がある。 </li></ol>

線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝...

線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物&#39;に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（&gt; 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 </EM&gt;コミュニティは、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ）。 多くの利点にもかかわらず、いくつかの実験的アプローチは、C言語で挑戦してきた虫 。これらは、組織または細胞型の細胞および単離の原形質膜へのアクセス可能性を必要とするものが挙げられる。確かにC。虫の組織は簡単に酵素処理または界面活性剤によって消化されない、その加圧された流体静力学的骨格内に閉じ込められる。 1990年代の終わりに、ミリアム·グッドマンとジャネットリッチモンドでの電気生理学的記録のための方法を開拓した虫その場 9,10 の神経細胞や筋肉細胞。これらの方法は、生体内での神経や筋肉の機能に私たちに重要な洞察を与えたが、彼 ​​らは挑戦的で低スループットである。 インビボで細胞機能を研究するための代替方法は、主に、特に、そのようなGCamPとカメレオン11-13として遺伝的にコードされたカルシウムセンサを用いてインビボカルシウムイメージングでは 、開発した。彼らは無傷で生きている動物に適用されるため、これらの方法は、しかし、薬理学的なツールの使用を許可していない。 培養にて最初の試み大規模な生体外での線虫細胞は、彼の博士論文14の調製時レアード·ブルームによって作られた。残念ながら、基板に対する細胞の接着不良で遭遇する困難は、貧弱な細胞分化および生存は、堅牢な細胞培養法として、この初期のプロトコルの確立を防止する。 1995年にエドガーらは手順を公表単一のCの単離および培養することによって細胞分裂と形態形成を調査する。虫は 15胚。酵素処理と手動解離の組み合わせで卵の殻の消化によって得られた胚細胞は、〜500のセル15までの生産、増殖し続けた。その後、レオンらは腸の形態形成を研究する割球数の少ない培養した。彼らは、1 試験管内孤立のE割球は、頂端接着結合16を介して互いに相互作用することにより、腸管腔に類似した構造を作成した偏腸細胞を生成することを示した。ブフナーらはまた、Cを培養するための同様の方法を報告した。試験管 17 内の胚細胞エレガンス 。 この初期の研究に基づいて、クリステンセンらは、胚のCを培養するための堅牢なプロトコルを開発した。試験管 1 で細胞エレガンス 。彼らその孤立したCが示された。虫細胞は、様々な細胞型に分化し、細胞特異的マーカーの発現を含め、それらがインビボで有する機能を維持することができる。 インビボで挑戦しているいくつかの技術は、単離されたC.上に塗布することができる胚細胞エレガンス 。これらは、電気生理学1,18 19、撮像、免疫化学的技法20,21、ならびに細胞特異的cDNAライブラリーの構築のため22,23（FACS）を蛍光活性化セルソーティングにより特定の細胞型の単離を含む。このようなRNA干渉（RNAi）などの遺伝子ノックダウン技術は、培養されたC.上に塗布することができる虫細胞1および糖タンパク質の発見のためのツールとしてアジド糖を用いて新規な代謝標識法は最近、 インビトロで培養C.ために開発されている虫の細胞24。 結論として、細胞培養法は、アレイを展開oをC.に適用することができるfの技法生体の文脈において遺伝子機能を解読するための努力においてエレガンスモデル 。ここではCを培養するためのプロトコルを記述大部分は最初のクリスチャンセンら1によって記述されたプロトコルに基づいており、in vitroで胚細胞を、 虫 。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。

C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫 トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での&gt; 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する?...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.4K ビュー.  University of Miami. ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布?...

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...