الأنسجة متعددة الخلايا المعقدة، وهذا البروتوكول يعيد تشكيل السلوك الخلوي بطريقة مبسطة. شيء واحد هو هذه التقنية لدراسة العلاقات المباشرة بين البروتونات الموصل الخلوية والاستجابة الخلوية. يستخدم هذا البروتوكول الخرز البوليسترين وظيفية كيميائيا لإعادة تكوين البروتونات موصل الخلوية.
الخرز يمكن قطع مع أي بروتونات من الفائدة، لاختبار آثارها على الاستجابة الخلوية. لقد استخدمنا هذه الطريقة في C-الأناقة على أجنة الماوس. لذلك ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول منتصبًا في دراسات الكائنات الحية الواسعة.
كما الأجنة هشة بعد ارتفاع المعالجة الكلوريت الكامل، مطلوب ممارسة كبيرة قبل واحد يمكن أن تعمل على عزل بنجاح blastomere. سوف العرض التوضيحي البصرية توفير فهم أكبر لكيفية واحد ينبغي التعامل مع الشعيرات الدموية أثناء أساليب عزل blastomere. للبدء, تزن 10 ملليمتر غرام من الخرز البوليسترين تعديل carboxylate في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل لتر.
إضافة ملليمتر واحد لتر من المخزن المؤقت MES في أنبوب لغسل. دوامة الأنبوب لخلط الخرز. تدور أنبوب لمدة 60 ثانية في 2000XG عن طريق جهاز طرد مركزي مقاعد البدلاء.
Dicard المابير عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت. غسل الخرز مرة أخرى مع واحد ملي لتر من المخزن المؤقت MES. بعد الغسيل، أضف ميلي لتر واحد من حاجز MES الذي يحتوي على 10 مللي جرام من EDAC في الأنبوب، لتنشيط مجموعات الكربوكسيل السطحية.
دوامة الأنبوب لخلط الخرز. تدوير واحتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تدور أسفل الخرز لمدة 60 ثانية في 2000XG.
تجاهل supernatant عن طريق pippetting بعناية خارج المخزن المؤقت ، وغسل مع واحد ملليمتر لتر من برنامج تلفزيوني. دوامة أنبوب لخلط الخرز وتكرار غسل برنامج تلفزيوني مرة أخرى. إعداد ملليمتر واحد لتر من واحد, 10, 100, واحد ألف مرة سلسلة التخفيف من رودامين الأحمر X من 0.65 مل لتر رودامين الأحمر-X حل الأسهم.
Pippette 20 ميكرو ليتر من الخرز في كل أنبوب تخفيف المسلسل. تدوير واحتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخرز مرتين مع واحد ملي لتر من برنامج تلفزيوني.
بعد الغسيل، أضف ميلي لتر واحد من برنامج تلفزيوني في الأنابيب وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أسابيع. تحقق من شدة الفلوريسنس من الخرز تحت المجهر المستخدم للتصوير الحي. عقد كل نهاية من الشعرية الصغيرة بسعة 10 ميكرو ليتر مع اليد اليمنى واليسرى.
سحب الشعيرات الدموية الصغيرة نحو كلا الطرفين لتطبيق التوتر وجلب مركز الشعيرات الدموية على الموقد لجعل اثنين من الشعيرات الدموية التي سحبت باليد. تحت المجهر تشريح، تقليم نصائح من الشعيرات الدموية التي سحبت باليد مع ملقط. جعل اثنين من الأحجام فتح طرف مرتين تقريبا، ومرات واحدة على طول الوصول قصيرة من الأجنة C-الأناقة لنقل الجنين وإزالة قشر البيض على التوالي.
إرفاق الشعيرات الدموية المسحوبة في جهاز الفم pippetting. Pippette 45 ميكرو ليتر من حل أملاح البيض على بئر من شريحة متعددة جيدا. ضع خمسة إلى 10 الكبار C-الأناقة على البئر.
للحصول على الأجنة C-Elegance المبكرة تقطع البالغين إلى قطع عن طريق وضع إبرتين إلى اليمين واليسار من جسم C-Elegance، وانزلاق الإبر الماضية بعضها البعض. Pippette 45 ميكرو لتر من محلول هيبوكلوريت على بئر بجوار محلول ملح البيض الذي يحتوي على البئر والميبست 45 ميكرو ليتر من شلتون متوسط النمو على الآبار الثلاثة اللاحقة. نقل مرحلة خلية واحدة واثنين من أوائل الأجنة مرحلة الخلية في حل هيبوكلوريت عن طريق pippette الفم مع فتحة أكبر حجما والانتظار لمدة 40 إلى 55 ثانية.
غسل الأجنة عن طريق نقلها إلى الآبار الثلاثة المقبلة مع شلتون النمو المتوسط. مع 1-2 ثانية في كل من أول بئرين. باستخدام شعري مرسومة باليد مع فتحة أصغر حجم تكرار بعناية pippetting الجنين لإزالة قشر البيض.
بعد ذلك، باستمرار pippette مع شعري مرسومة باليد لفصل blastomeres مرحلة من خليتين. بعد إزالة قشر البيض، تقليل قوة في pippetting الأجنة صعودا وهبوطا لمنع انفجار. إعداد غرفة التصوير عن طريق وضع غطاء على حامل غطاء وشريط حواف الغطاء لطعنه.
قم بقلب حامل الغطاء، وارسم دائرة على الغطاء مع قلم مزهر. إضافة شيلتون 'sنمو المتوسطة داخل الدائرة التي رسمها علامة مبيدة للماء، ونقل blastomere معزولة إلى غرفة التصوير داخل الدائرة. الآن، الاستغناء عن حجم صغير من الخرز وظيفية كيميائيا على غطاء باستخدام الشعيرات الدموية مرسومة باليد مع فتحة أكبر.
السيطرة على موقف من الخرز عن طريق تهب في شعرية مرسومة باليد حتى تعلق الخرز على blastomere معزولة. قم بتركيب الغطاء لتجنب تبخر المتوسط وأداء التصوير الحي باستخدام مجهر مقلوب. في هذه الدراسة, إشارة الفلورسنت من حبة تعامل مع 0.005 ميكرو غرام لكل مللي لتر رودامين الأحمر-X Succinimidyl استر لسلالة المعدلة وراثيا التعبير عن ميوزين-2 و M-cherihistone كانت ضعيفة جدا.
من ناحية أخرى، كانت إشارة الفلورسنت من الخرز المعالجة بخمسة ميكرو جرام لكل مللي لتر رودامين الأحمر-X Succinimidyl إستر قوية جدا. وكان تركيز رودامين الأحمر-X Succinimidyl إستر في 0.5 غرام صغير لكل مللي لتر الأمثل لهذه السلالة المعدلة وراثيا خاصة. وخلال التصوير الحي تم تحديد طائرة حيث تم محاذاة اثنين من ال centrosomes عموديا.
الطائرة مع زائد أو ناقص زاوية 90 درجة من هذا المستوى هو الطائرة المغزل. زاوية اتجاه المغزل نسبة إلى واجهة الاتصال خلية / حبة بعد السيتوكينات يظهر أن كلا الخلايا ابنة كانت تعلق على حبة في خط يمر كل من مشاهد الاتصال تم استخدامه كتوجه الاتصال. يحتاج المرء إلى معرفة كيفية رد فعل الأجنة وقشر البيض على بعض القوى الخارجية التي يطبقها pippette الفم.
نظريا، يمكن دراسة أي استجابة الخلوية، على سبيل المثال، يمكن دراسة مواصفات كبريتات من قبل الخلايا زراعة والاتصال مع الخرز لاصقة على مدى أطول. وقد استخدمت هذه التقنية لفهم الاتصال التابعة لـ آلية توجيه تقسيم الخلايا. تم استخدام مرشح PTF لمنع استنشاق أبخرة محلول هيبوكلوريت عن طريق pippette الفم.
