この実用的で再現可能な方法は、無傷のマウス内で白血球のリクルートにつながる白血球内相互作用を可視化するために使用することができる。この技術はまた、生体内の白血球募集カスケード内の生理学的および病態生理学的プロセスのモニタリングのための強力なツールを提示する。この方法は、異なる炎症性および敗血症モデルに適用することができる。
例えば、我々は最近、誇張された筋白血球浸潤を含む筋病的な研究におけるその関連性を強調した。この技術を使用することを検討している仲間の科学者への私たちの提案は、方法がわずかな偏差に非常に影響を受けやすいようにできるだけ多くの実践的な経験を得るです。この手順を実証することは、私の研究室の臨床医でシニアサイエンティストのサイモン・クラニッヒです。
麻酔実験動物のつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、37°Cの加熱パッドの後回しリカンベント位置にマウスを固定し、非吸収性無菌6-0縫合糸を使用して前歯の周りに単純なループを巻きます。縫合糸の結合端を加熱パッドにテープで貼り付け、ピンセットを使用して中線で皮膚を静かに持ち上げます。次に、首と上部胸郭の上に直径1〜2センチメートルの円形の切開を行い、ピンセットを使用して周囲の筋肉、脂肪、および結合組織を慎重に解剖します。
気管の下に縫合糸を置きます。小さな手術用はさみを使用して、約1.3ミリメートルの横方向を気管に切り込み、気管の尾端にポリエチレンチューブを導入して上気道を固定します。単一の円形の結び目の縫合線で位置するチューブを固定し、気管の右側に沿って頸動脈を見つけます。
頸動脈壁から周囲の組織を解剖し、動脈の下に縫合の2つの部分を渡します。頸動脈の分岐に最初の頭蓋縫合を結び、結びつけずに第1縫合糸から約5〜8ミリメートル遠位の第2縫合糸を配置する。次に、生理食塩水で満たされた1ミリリットルの注射針に30センチメートルのポリエチレンチューブを取り付け、7ミリメートルの容器クリップを使用して頸動脈を第2縫合糸に遠位クランプします。
頸動脈で約0.5ミリメートルの横切り切断を行い、無菌ポリエチレンチューブを動脈に導入します。チューブを2番目の縫合線で固定し、容器クリップを取り外します。その後、注射器プランジャーを静かに押し込み、生理食い物を容器に流します。
クレマスターの筋肉を準備するには、陰嚢を顕微鏡ステージに向けてカスタムメイドのプラスチック顕微鏡フレームにマウスを移し、ピンセットで最も遠位の端にある陰嚢を慎重に把握します。陰嚢を優しく引っ張り、開いた組織を生理食塩水で十分に保ち、陰嚢皮膚の直径約5ミリメートルの円形部分を取り除く。緩い結合組織を解剖し、両方の精巣を見つけるために2つのピンセットを使用してください。
1つの試験を遠位につかみ、周囲の結合組織を段階的に取り除く生殖組織をそっと引き出し始める。精巣が外装されたら、組織の遠位端をステージを囲むゴムリングに固定し、生理食塩水で組織を水分補給します。次に、基礎となるクレマスター筋に害を与えることなく、結合組織を慎重に除去する。
基礎となるクレマスターの筋肉に害を与えることなく、ぼやけた画像をもたらす結合組織のすべてを削除することが重要です。すべての組織が取り除かれたら、1ミリメートルの横切り切開を行い、クレマスター筋肉を開き、非常に遠位から組織の近位端までの縦切りを行います。筋肉は球状に開くはずです。
慎重にガラスのステージ上に筋肉を広げ、組織の中央領域に触れたり害を与えたりしないように注意してゴムリングに筋肉を固定します。次に、残りの精巣を側面に固定して、関心のある領域にアクセスし、PSSで組織を水和します。筋肉血管系の生体内可視化のために、取り付けられたクレマスター筋を直立顕微鏡に入れ、40倍の目的を選択する。
顕微鏡の直立的な目的にテーピングされた小さなチューブを通して35〜37°CのPSSで連続的な重ね合わの下で録音を行い、筋肉と組織に目的と一緒にPSSの連続滴下を可能にします。毛細血管後の小胞を特定します。直径20~40マイクロメートルの小胞の微小循環を測定します。
次に、30秒の期間にわたってクレマスター筋肉からの微小循環の高解像度画像を記録し、筋肉組織の収縮および弛緩のわずかな変化による焦点を連続的に調整する。過剰な結合組織は、ぼやけた顕微鏡画像につながることができます。この代表的な顕微鏡画像では、直径20〜40マイクロメートルの間にあるはずのポストキャピラリー小胞は、2つの小さな血管の合流によって識別することができる。
白血球を循環しながら接着性および転がり白血球を視覚化することができるが、記録されたビデオのスローモーション再生でのみ追跡され得る。多数のパラメータが、心拍出量、血管径、中心線速度、壁せん断速度、循環白血球の数を含む、生体内での白血球の採用に影響を与える可能性があります。なお、中心線速度は心拍出量、末梢血管抵抗、および血管内容積の影響を受ける。
例えば、頸動脈カテーテルを介して与えられたローダミンまたは他の実験物質の大量は、毛細管の中心線速度を増加させ、白血球の捕獲および転動を阻害する。それどころか、心不全、深部麻酔、または低体温は、毛細血管後の流れを減少させる可能性がある。中心線速度を決定するために、蛍光白血球を自由に循環させるか、または白血球をローダミンのような蛍光試薬で染色しなければならない。
なお、野生型株は生理学的分散を示し得る。例えば、C57BL/6マウスは、C57BL/10ScSn動物と比較して、白血球の転がり、接着、およびトランスマイグレーションを明確に増強した。計画段階と標準化段階は、特に顕微鏡のためのクレマスター筋肉の調製中に技術を習得するために重要です。
白血球の採用を視覚化するための他の方法は、追加情報を得るために、および採用カスケードに白血球および内皮細胞の個々の貢献を解剖するのを助けるために行うことができる。この技術は、薬理学的瞑想者および新しい免疫調節物質の前臨床評価のためのプラットフォームを提供する。
