我々は、Foxp3 - KI GFP / GFPの親切な寄付のために我々の動物ホルダーと加熱パッドと博士ビジェイK. Kuchrooを構築するためにロジスティックのヘルプはこの原稿の批判的検討、博士ヌーノモレノのためにデビッドオリビエリに感謝しますマウス。この作品は、&quot;FundaçãoパラCiênciaのe Tecnologia&quot;（FCT、ポルトガル）、助成金＃PTDC/EBB-BIO/115514/2009によってサポートされています。

1。動物の準備重要な注意事項：BM細胞懸濁液および胸腺移植は無菌条件下で行った。胸腺移植が私たちの動物施設内にある手術室で行われている間BM懸濁液は、私たちの細胞培養室のフードの内側を調製した。これらの無菌状態を維持し、保証するために、我々はこれらの場所で私たちのビデオを記録することはできませんでした。しかし、全ての手術材料はオートクレーブと外科ベンチは、以前はVirkon（Pharmacal研究所（株））および70％エタノールで洗浄した。すべての手順は、動物実験によって承認され、委員会（IACUC）を使用して、彼らはヨーロッパの実験動物学協会（FELASA）ディレクティブの連盟との合意にであった。承認ID番号がAO10/2010です。すべての画像実験では、ターミナルの手順だったと動物は、画像の終わりの直後に安楽死させ、買収。 詳細な手順は次の通りです： <ol><li>照射（γ-照射装置付き）骨髄（BM）の内部に内因性造血前駆細胞を破壊するために900ラドを8週齢のヌードマウス。あなたが静脈内注射、さらにBM再構築のためにドナー骨髄細胞を調製するまで照射した後、それらのケージに動物を返します。このBMの転送は、照射1時間後に実施した。 </li><li> BMドナー動物を区切ります。つの動物の後肢の脛骨と大腿骨は、一般的に最大3レシピエント動物に再構成するのに十分です。 CO 2で安楽死した後、後肢を削除してから、骨から皮膚と筋肉を取り除く。 </li><li>各骨の閉鎖端をカットし、PBSでそれをフラッシュ（またはRPMI）またはBMを削除するにはPBSを2ml（またはRPMI）で、乳棒を用いて、すり鉢ですべてを押しつぶす。 </li><li>活発な吸引USIの繰り返しによる単一細胞懸濁液中にBM構造を混乱させるP1000ピペットNG。別の方法としては、21G注射針を通して何度もBMを渡すことができます。遠心（400グラム、5分、RT）は、PBSで細胞を再サスペンドし、ヌード照射レシピエントに静脈内注入する。我々の実験で我々はすべての制御性T細胞（Treg）はGFP 1を発現するFoxp3を- KI GFP / GFPマウス由来の BM使用。 </li><li>非BM -再構成された動物は14日以上生き残ることができないので、ドナーBMの受け入れは、転送後の最初の日で発生します。しかし、1つはすべてBMコンパートメントの完全な回復を可能にするために4〜6週間待つ必要があります。 Bactrim（ロシュ）は、細菌感染症のリスクを減少させるために照射後の最初の週の間に水（2 mg / mlの）に追加されました。 </li><li>胚性胸腺移植は、既に2を説明されました。簡単に言えば、同質遺伝子マウスの繁殖ペアを起動し、プラグ（性交の証拠）毎日チェックしてください。 pregnの15日目の別のプラグインの女性とCO 2安楽死、それらアンシー（プラグの観察は、妊娠の1日目です）。胚および胸腺を削除します。転送されるまで冷PBSで胚性胸腺を置きます。 </li><li>胸腺移植を実行するには、ケタミン（マウスの体重の120μg/ gの）/キシラジンで麻酔BM -受信者ヌードマウス（マウスの体重の16μg/ gの）と37℃で加熱パッドの上にそれらを保つ° Cが得られるまで意識不明。 </li><li>外科的に胸腺の移植を実行するために腎臓を公開。最初ChloraPrep（Carefusion社）および70％エタノールで肌をスクラブ。その後、動物の背側体の部分の皮膚をカット1 cmの2ミリメートル怒鳴る最後の胸部肋骨を行います。 </li><li>腹腔をカットし、この空洞の腎臓を引き出します。手術用メスの刃と腎被膜の小さな表面的なカットを行います。非常に薄いチップで鉗子を使用すると、レシピエントマウスの腎被膜下に袋を作り、このポーチに4胸腺葉まで追加。 </li><li>腎臓bを置く<html>その代わりにACK、1つまたは2つのステッチで腹腔を縫合し、次に同じ縫合法を使用してマウスの皮膚を閉じます。また、縫合糸は、外科的接着剤を使用して行うことができます。 </li><li>皮下右動物の苦痛を避けるために、彼らは麻酔から回復し始めるまで加熱パッドで動物を維持するために手術を終えて（5 mg / kgでブトルファノール）鎮痛剤注入。マウスは、糸を除去するから、ケージメイトを防ぐために、移植後最初の3日間は個別にケージに入れています。 1週間後に抜糸する。 </li><li>ヌードマウスはT細胞を持っていない。したがって、血中のCD4 +またはCD8 + T細胞の割合を監視することにより、胸腺移植の受け入れを評価することができます。週一回、胸腺移植後2週間、動物の出血、抗CD4、抗CD8モノクローナル抗体（MAb）と血に染まる。 CD4する場合：CD8比は約2:1である、移植胸腺は（図1）完全に機能します。 </li></ol>&quot;&gt; 2。生体内画像取得あなたが事前に必要とそれらを脇に置くすべての材料を準備します。 <ol><li>ケタミン/キシラジン（項目1.5で説明したのと同じ用量）と37℃の加熱パッドの上にそれらを配置℃で動物を麻酔血流の未来の可視化を可能にするために静脈内ローダミンBイソチオシアネート - デキストラン（PBS中20 mg / mlの）の100μlを注入する。 </li><li>以前の項目1.6に記載されたプロトコールにしたがって移植胸腺を含む腎臓を公開。 </li><li>元の位置に戻ってから腎臓を防止するために、針で皮膚の切開の側面を閉じます。 </li><li>それは湿った保つために臓器の上にPBSに浸した綿のピースを置きます。 </li><li>動物ホルダーの段階（図2A）の上に加温パッドを置く。 </li><li>動物の所有者、オルガンの上（図2B）に加熱パッドの上に動物を置く。 </li><li>クランプmで、両側で臓器をつまんで薄いアルミ箔のADE（図2C）。 </li><li>動物のホルダーを閉じて、できるだけ近いあなたの組織（図2D）にトップヒータープローブを置きます。このヒータープローブは常に臓器の温度を測定し、37℃でそれを維持し、電流を調整するヒーターには、この情報を送信します</li><li> PBSに浸した綿を取り出して、℃のあなたの準備の上に30℃の低融点アガロースを（PBS中2％）に追加します。 </li><li>上部ヒーター（図2E）と製剤全体をカバーしています。このヒーターの絞りで客観的な（図2F）からアガロースを隔離カバーガラスがあります。マウスの麻酔を監視し、すべての40分をブーストハーフ用量を注入する。画像取得後、CO 2で動物を安楽死させる。 </li></ol> 注：アルミホイルのクリップと上部ヒーターの写真を図3に示されている。 3。二光子イメージング買収私たちは、直立&quot;プレーリーアルティマXY&quot;二光子顕微鏡を使用。我々のシステムは、Tiが搭載されています：サファイアレーザー、同時最大4チャンネルの買収のための4つの最上位光電子増倍管と20倍の水浸対物レンズを。 <ol><li>チタンをオンにする：サファイアレーザーと全体の顕微鏡システムを。 </li><li>所望の波長に応じてダイクロイックミラーとフィルターセットを追加。我々のケースでは565 nmのダイクロイックミラーを含むオリンパス- BX2クロマホルダー、一50分の525 nmフィルター（Foxp3を- GFPの信号用）、および1 50分の595 nmフィルターを（血管の内側デキストラン-ローダミン- B信号の使用）。使用するレーザーの波長範囲は880から900nmの間であった。 </li><li>顕微鏡に動物のホルダーを追加し、接続して、すべてのヒーターをオンに、慎重に水の中に目標を下げて、容器または一部GFP - Tregsのに焦点を当て、上部ヒーター開口部に水を加える。 </li><li>顕微鏡でのx、y、zの外部コントロールは、迅速に領域を見つけるために組織を調査<html>興味のある。 </li><li>色分解を最適化し、背景の上に十分な信号を達成するために必要なレーザーの量を最小限に抑えるために光電子増倍管のゲインを調整します。あなたの組織の光損傷を避けるために、レーザーの最小量を使用するようにしてください。 </li><li>興味の領域が特定されると、タイムラプスイメージングを開始する。私たちのケースでは、典型的な5D（X、Y、Z、T、および色）買収のプロトコルは4.0μm、Z -手順、xと140μmのyの長さに分け、50μmの深さの組織ボリュームの連続した​​画像を取得で構成されていますそれぞれ。各ボリュームには、取得するのに30秒かかります。したがって、60の買収は、画像取得の約30分を実行します。 </li><li>機関のサーバーにデータを転送し、多次元のレンダリングとセルのトラッキングを実行するにはImageJの、Imaris、またはVolocityソフトウェアを使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果<html> g1.jpg&quot;/&gt; 図1。 。胚の胸腺の受け入れと機能は、BM回復した後、胚の胸腺は、BM再構成された動物に移植し、2週間胸腺移植後に、これらのマウスは、抗CD4または抗- CD8を染色することによってT細胞のサブタイプの割合を監視するために、週に一度採血したモノクローナル抗体。我々は、胸腺が正常CD4を持つ動物に受け入れられたとみなさ：1.5-2.0:1周りCD8比（）。その機能を確認するために、我々はいくつかの胸腺移植動物を屠殺し、WTマウス（B）と異なる胸腺細胞亜集団の割合を比較した。ダブルネガティブ（DN; - CD8 - CD4胸腺細胞）の割合サブポピュレーション（抗CD25および抗CD44モノクローナル抗体で染色することによって）、ダブルポジティブ（DP、CD4 +がCD8 +胸腺細胞）と、シングルポジティブ（SP）CD4 +またはCD8 +胸腺細胞、これらの動物間で類似していた。 ig2.jpg&quot;/&gt; 図2。アニマルホルダアセンブリ。深く麻酔した後、動物は、以前は動物ホルダーのステージ（）の上部に取り付けられた、加熱パッドの上に置かれます。移植胸腺を含む腎臓は、（B）上を向いている。アルミ箔のクランプは、繊細にその場所で保つために全体の腎臓（C）をつまみ。図。 1Cの挿入は、詳細にクランプを示しています。動物のホルダーの上部は場所（D）に置かれます。 PBSに浸した綿は暖かい低融点アガロースで置き換えオルガンの上、から削除され、上部ヒーターは（E）が追加されます。最後に、全体のアセンブリは、ここでの目的（F）で表される、顕微鏡に転送されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> 図3。ホルダー部分の詳細。これらの写真は、腎臓を保持しているアルミ箔のクランプを（）（B）を示す。移植胸腺が配置されている地域にも注意してください。これは、約領域を示しています胸腺カプセルをカットし、胚の胸腺を入れるポケットを作るために。トップヒーターのカバーガラス（C）はその底の部分（D）へのシリコーン接着剤で固定した。 ムービー1。酸素と温度の生理的なレベル（37℃）が全体のプロセス中に保持された胸腺内のFoxp3を- GFP +胸腺細胞の生体内イメージング。血流とTregsのの動きに注意してください。これらの速度を測定し、公表データと比較することができます。 <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">ムービーを表示するにはここをクリック。</a> 映画（2）の画像を30で取得された胸腺内部の制御性Tの生体内イメージング℃に血流の維持にもかかわらず、動きと細胞の丸い形がないことに注意してください。 <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">ムービーを表示するにはここをクリック。</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

本稿では、生きている動物内の胸腺細胞の二光子励起イメージングのための手順を示した。我々はまた、血流の継続と撮像法の間に臓器の温度のメンテナンスとして、1つは注意深く制御する必要のあるいくつかのパラメータを説明した。それにもかかわらず、臓器を安定に保つために慎重な努力にもかかわらず、そのような&quot;臓器漂流&quot;のようなモーションアーチファクトが発生する可能性があります。後部画像補正は、この目的のために特別に設計されたアルゴリズムの開発によって行うことができます。さらに画像解析には、エラーを最小限にしようと新しいプロトコルの開発の源である可能性があります。 胸腺は、すべてのT細胞が産生される器官であると、したがって、その免疫がγδの世代を理解することに興味がある臓器、CD4、またはCD8 T細胞は、彼らの注意を焦点を当てます。 T細胞に関するほとんどの研究は、これらのC言語の数字の違いおよび/または安定性に基づいています。in vitroで/ in vivoでの操作で別の後にells。しかし、唯一のin vivoで可視化した後、我々は、恒常性3-7を維持に伴う免疫系の細胞との相互作用を観察できる。従って、胸腺細胞のin vivoでの観察に優れたT細胞生物学を理解することがおそらく最も重要な情報が欠落しての一つです。生体内TPMは、T細胞の動きとの相互作用の詳細な画像を提供し、我々は、それが詳細な胸腺細胞の研究のために使用する方法をここに示しています。しかし、すべての技法には制限があります。生体内イメージング買収は体内の細胞の振る舞いを反映するための最も正確なシステムですが、それは臓器の植画像取得が少ない労力で、免疫システム8,9に関する重要な情報を収集するために使用されていることも事実である。さらに、1つは、生体内イメージング法は、麻酔動物での組織や血管を露出させる手術を必​​要と否定することはできませんそれ自体はこれは、全臓器生理学10の変化を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、開発されている外科手術11および新しい方法に起因するアーティファクトを廃止し非侵襲的な方法がありますそれより12を使用される動物は、事前に準備する。したがって、新しい外科的処置と通行料が最小化またはバイパス生体内イメージング買収の実際の制限をし、より多くの科学コミュニティにアクセスできるようになります。 我々は我々が説明した方法は実現可能であり、それは我々が使用していることを、in vivoでの全身操作、そのような薬剤投与にすべて報告していることを実証している。従って、我々は、胸腺細胞の開発に関する更なる研究を補完し、強化するためにすでに利用可能なex vivoでのテクニックと一緒に、このメソッドの使用方法を示唆している。

<table border="1"><thead><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr></thead><tbody><tr><td>ローダミンB ishothiocyanate -デキストラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R9379 </td><td> 20 mg / mlのに在庫を準備</td></tr><tr><td>二光子顕微鏡</td><td>プレーリーテクノロジーズ株式会社</td><td>プレーリーウルティマXY </td><td></td></tr><tr><td>チタン：サファイアレーザー</td><td>コヒーレント社</td><td>カメレオンウルトラファミリー</td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA液浸対物レンズ</td><td>オリンパス（株） </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td>ホルダー（フィルター/ダイクロイック） </td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 91018 BX2（U - MF2） </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50フィルター</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50フィルター</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nmのダイクロイック</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imarisソフトウェア</td><td>ビットプレーンAG社</td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td>パーキンエルマー社</td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJの</td><td> NIH、米国</td><td> ImageJの</td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

二光子顕微鏡（TPM）は、組織や器官の奥深くの領域での画像取り込みを提供します。新しい定位ツールや外科的手技の開発と組み合わせることで、TPMは、臓器内部の&quot;ニッチ&quot;を特定し、生きた動物で細胞の&quot;振る舞い&quot;を文書化する強力なテクニックになります。生体内イメージングが最高の臓器内に実際の細胞挙動のような情報を提供していますが、それは多くの手間と技術的に代替のex vivoイメージングの買収よりも、必要な機器/手続きの面で厳しいの両方です。従って、我々は外科手術と私たちは胸腺内でのFoxp3 +細胞の移動を追跡することができる小説&quot;定位&quot;オルガンホルダーを説明します。 Foxp3は制御性T細胞（Treg）の世代のためのマスターレギュレータです。すなわち：また、これらの細胞は、その起源に応じて分類することができます。胸腺分化制御性T Oとして、（nTregs）&quot;天然に存在する制御性T&quot;と呼ばれています末梢変換Tregsの（pTregs）にpposed。研究のかなりの量がこれらのT細胞の表現型と生理学に関する文献で ​​報告されているが、ほとんどは他の細胞とのin vivo相互作用について知られている。この欠陥は、そのような観測を可能にする技法の欠如に起因する可能性があります。このホワイトペーパーで説明されているプロトコルは、このような状況のための救済策を提供します。 我々のプロトコルは、胸腺上皮細胞を含むいくつかの上皮細胞の分化を損なうDNA配列の厳守変異を持っているので、内因性の胸腺を欠くヌードマウスを用いて構成されています。ヌードマウスは、ガンマ線照射されたとFoxp3 - KI GFP / GFPマウスから骨の髄（BM）で再構成。 BMの回復（6週間）の後、各動物は、腎被膜の内部に胚性胸腺移植を受けた。胸腺受け入れ（6週間）の後、動物を麻酔し、腎臓が含む移植胸腺は、露出して私たちの臓器のホルダーで固定されており、TPMによるin vivoイメージングのための生理的条件下で維持した。我々は、制御性T細胞の発生における薬物の影響を研究するためにこのアプローチを使用している。

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で&quot;ニッチ&quot;の同定に役立つはずです。

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K ビュー.  Instituto Gulbenkian de Ciência. 我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で"ニッチ"の同定に役立つはずです。

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

免疫・感染学

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...