このプロトコルの使用によって研究者は、進行前立腺癌のための新しいエキソームまたは細胞外小胞ベースおよび組織ベースの微小細胞を同定することができる。F-F-B組織と細胞外小胞の両方からRNAを分離することは、そのほとんどが作成されているか、限られた量であるため、多くの場合、次世代シーケンシングのための最も特異的な自由で高品質なデータを生成するためにR-N-A入力およびC-D-N-Aライブラリを最適化するためのさまざまな方法について詳しく説明します。次世代シーケンシングは、この粒子が前立腺癌臨床サンプルで最適化された腫瘍進行の根底にある腫瘍の分子変化を理解するための最も包括的なプラットフォームを提供し、進行した積極的な前立腺癌の基礎生物学に関する新しい洞察を提供することができる。
低入力材料からC-D-N-Aライブラリを最適化することは、正しい結果を得るために高品質のC-D-N-Aライブラリを生成することが非常に重要であるため、シーケンス実行を成功させるための重要なステップです。先に行われたように組織の微細解剖を行った後、血清由来E-Vの患者血清サンプルの解凍列を摂氏4度で分離する。解凍した血清サンプルの110マイクロリットルをチューブに移し、2000回Gで30分間回転します。
その後のE-Vまたはエキソソーム分離のためにスーパーナデンを選び、デブレペレットを捨てます。スーパーナテントに血清エキソソーム分離試薬の30マイクロレターで。摂氏4度を30分間インキュベートします。
10分間Gの1万倍のスピン。E-Vスーパーネートを慎重に選び、別の1.5ミリリットルチューブにペレットを邪魔することなく、将来の分析のためにマイナス80°Cを保存します。その後、ヌクレアーゼフリー水で調製した70マイクロリットルのP-B-SでE-Vペレットを再懸濁する。
マイクロ解剖組織から総R-N-Aを分離した後、精製されたE-Vの市販キットを使用して、3つのプライムアダプターの1マイクロリットルで1マイクロリットルR-N-Aサンプル当たり5マイクログラムにライブラリ調製を行います。サーマルサイクラーを摂氏70度に予熱し、サンプルを2分間インキュベートします。すぐに氷の上にサンプルを移す。
別のチューブでは、2マイクロリットルのライゲーションバッファー、RNase阻害剤の1マイクロリットル、T4 RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを混合し、欠失変異体を含む。バイパイの寝具を上下に混ぜます。その後、氷の上にR-N-A 3プライムアダプターでチューブにミックスの4マイクロリットルを追加します。
サーマルサイクラーを摂氏28度に予熱します。そして、1時間インキュベートするためにサーマルサイクラーにチューブを置きます。その後、サンプルをサーマルサイクラーに入れたままチューブに1マイクロリットルのストップ液を加えます。
摂氏28度でさらに15分間インキュベートします。その後、すぐにチューブを取り外し、氷の上に保ちます。別のチューブに5つの素数アダプターの1マイクロリットルを追加します。
摂氏70度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。そして2分間インキュベートします。すぐにチューブを氷の上に置き、アダプターの再焼を防ぎます。
Dネイチャー5素数アダプタのチューブに10ミリモールA-T-Pの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜ、ミックスにT4 R-N-Aリガーゼの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜます。
この混合物の3マイクロリットルを、R-N-Aを結紮した3つの素数アダプタを含むチューブに移します。28°Cに予熱したサーマルサイクラーにチューブを置き、1時間インキュベートします。その後すぐに氷にチューブを転送し、サンプルでさらに進むか、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存します。
R-T-P-C-Rを実行するには、各アダプタの6つのマイクロライガーをR-N-Aに結び付け、R-N-A R-Tプライマーのマイクロライガーを1個追加します。チューブを摂氏70度に予熱したサーマルサイクラーに移し、2分間インキュベートします。チューブを氷に移します。
別のチューブには、2マイクロリットルの5X、ストランドバッファー、12.5ミリモラーDNTPの5マイクロリットル、100ミリモルDTTの1マイクロリットル、R-N-A阻害剤の1マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素を混合する。この混合物の5マイクロリットルをアダプターの連結RNAに加え、50°Cに予熱されたサーマルサイクラーに移して1時間インキュベートします。1時間後、アダプターは、すぐに氷に無料のDNAを結び付けた。
別のチューブには、25マイクロリットルのPCRミックス、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー指数、および8.5マイクロリットルのRNAの遊離水を混合します。このミックスの37.5マイクロリットルを、CDNAを結び付けるアダプターの12.5マイクロリットルに加えます。チューブを摂氏98度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。
サイクル番号を 15 に変更して、製造元のプロトコルで提案されているようにサーマルサイクラーをプログラムします。完了後、サンプルを摂氏4度に保ちます。今後の使用のためにマイナス80°Cで進むか、保存してください。
結紮された無料DNAを精製するには、10マイクロリットルのDNAローディング色素を各無料のDNAサンプルに加えます。そして、後者の高解像度とカスタムRNAの10マイクロリットルに。6%TBEポリアクリルアミドゲルで互いに隣接する2つの別々のレーンで各サンプルの30マイクロリットルを実行します。
カスタムRNA後者と高解像度後者では、2つの異なるサンプル間の中間空間。1X TBEバッファー内でゲルを145ボルトで約30~40分間実行します。ローディング色素の下の青い前面を追跡します。
ゲルの底に近づくと電気泳動を停止します。ゲルを1つのX TBEバッファーに1ミリメートル当たり5マイクログラムの臭化エチジウムで移動します。トランスイルミネーションでゲルを視覚化し、145ベースペアと160ベースペアマーカーの間でゲルを正確にカットし、145ベースペアマーカーのわずかに上に切り取り、アダプタダイマーによる汚染を避けます。
重要なステップは、アダプターダイマーが望ましいブランドに非常に失われるように正確にゲルを切断することによって行われる精製合体CDNAです。ゲル片を2ミリメートルの回収チューブに保管されたDNA破断チューブに移します。2分間Gの20,000倍でスピンします。
そして、RNaseフリーの水の300マイクロリットルを追加し、室温で一晩ロッカー上で穏やかに回転させます。翌日にDNA沈殿を行うために、チューブの内容物を5ミクロンのフィルターチューブに移した。厳密に10秒間600回Gをスピンします。
次に、3つの酢酸モルナトリウム、1Xペレット塗料、975マイクロリットルの100%エタノールのグリコーゲン30マイクロリットルを2マイクロリットル加え、DNAを溶出させます。摂氏4度で17,000倍のGで20分間スピンします。上清を捨て、75%エタノールを加え、ペレットを洗浄します。
4°Cで17千倍Gで5分間回転した後、上清を捨て、熱ブロック上で37°Cでチューブをインキュベートし、エタノールを完全に蒸発させます。再び12マイクロリットルの10ミリモルトリシダークロリドをPH8.5で懸濁します。次に、精製された無料のDNAを10回希釈し、希釈したCDNAの1マイクロリットルを使用してバイオアナライザー上で実行することにより、ライブラリ品質チェックを実行します。
無料のDNA製品サイズが、136と160塩基対の間のエレクトロフェログラム内の小さなRNAの範囲に対応していることを確認してください。各サンプルの総モルシティを計算します。PH8.5で塩酸トリ酸塩を使用して、各サンプルを2ナノモルに正規化します。
200マイクロリットルの各ナノモルサンプルの等量を1つの200マイクロリットルPCRチューブに混合してライブラリを保持します。原稿に記載されている手順に従って変性および順序を変性する。本研究では、RNAの単離後にライブラリを作成し、品質チェックを行った。
アダプターの連結されたマイクロRnaseの製品サイズは、各サンプルの約136〜160塩基対に対応した。強調表示されたセクションは、調製の小さなRNAライブラリーのために正確に切除されたゲルの範囲を示しています。この図は、精製された無料DNAライブラリー用のゲル電気泳動とエレクトロフェログラムを示しています。
マイクロ解剖されたFFPE組織および血清由来EV.小さなRNAシーケンシングランからの代表的な指標は、予想されるクラスター密度、Qスコア、クラスター通過フィルタパーセンテージ、およびマイクロ解剖されたFFP組織および血清由来EVの推定収量および誤差率を示す。両方のサンプルのQスコアは、ベースコール精度の99.9パーセントを示す3つ以上の値を示した。
そして、エラー率はすべて1を下回っていました。ライブラリの準備の各ステップは慎重に実行する必要があり、チューブは、各インキュベーション後すぐに氷に移す必要があります。プロトコルの重要なステップは、アダプターダイマーフリーで純粋なCDNAライブラリを持っていることを確認するためにゲルを正確に切断することです。
CDNAライブラリを生成するには、高品質のシーケンス実行を最適化する必要があります。このプロトコルを理解することは、限られたソースサンプルからの他のシーケンシングライブラリの準備にこれらの微細な詳細を外挿する視聴者が血清および細胞外小胞を示唆するのに役立ちます。この技術は、転移性前立腺癌患者における腫瘍化アグレッシブおよび治療抵抗性に関連する新しいミクロナーゼを同定するのに役立った。
これらの技術は、新規バイオマーカー発見に役立つ他の疾患タイプに外挿することができる。この技術は、ストリオン由来の血清や組織サンプルなどの生物学的材料を使用するので、適切な予防措置を講じる必要があります。さらに、臭化エチジウムは既知の発がん性物質であり、このプロトコルを使用して非常に慎重に取り扱う必要があります。
