ミトコンドリアの変化は、ヒト卵巣癌において重要な役割を果たす。このプロトコルは、ヒト卵巣癌および大規模プロテオミクス分析のための対照組織からミトコンドリアを分離し、精製するための効果的なプラットフォームを確立する。ミトコンドリアは、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達、酸化ストレスの中心として、卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオーム変化に関する洞察が、我々の理解分子機構に利益をもたらし、効果的なバイオマーカーおよび治療標的の発見である。
この技術は、対照組織におけるヒト卵巣癌からミトコンドリアを分離するために、密度勾配遠心分離と組み合わせて微分速度遠心分離を使用し、定量プロテオミクス分析のための高品質のミトコンドリアサンプルをもたらす。ミトコンドリア製剤は、iTRAQ定量プロテオミクスと相まって、ヒト卵巣癌組織の分析にうまく使用されており、他の組織であるミトコンドリアプロテオミクスを容易に分析するために翻訳されています。この方法を行ったことがない人は、癌組織よりも卵巣制御からミトコンドリアを分離することが困難である可能性があります。
コントロール組織の均質化を改善し、ミトコンドリア分離を改善するために密度勾配培地の余分な層を追加するためにトリプシンを追加する必要があります。.この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、ミトコンドリア分離バッファーの250ミリリットルを調製する。約1.5グラムの卵巣癌組織をきれいなガラス皿に入れます。
2ミリリットルの前チルドミトコンドリア分離バッファーを加え、組織表面から血液を軽く洗います。この洗浄を3回繰り返します。次に、きれいな眼科用のはさみを使用して、組織を約1立方ミリメートルの部分に完全にミンチし、50ミリリットルの遠心分離管に細かく組織を移します。
1ミリリットル当たり0.2ミリグラムの濃度でナゲスを含むミトコンドリア分離バッファーを13.5ミリリットル加えます。電子ホモジナイザーを使用して、みじん切り組織を摂氏4度で2分間均質化します。この後、ミトコンドリア分離バッファーの別の 3 ミリリットルを組織のホモジナイートに加え、ピペット処理によってよく混合します。
作製した組織を1、300xg、摂氏4度で10分間ホモジュする。ペレットを取り出し、上清を保持します。次に、上清を10,000 xgで、摂氏4度で10分間遠心します。
ミクロソーム含有上清を取り出し、ペレットを保持します。ミトコンドリア分離バッファーを 2 ミリリットル加え、ペレットを軽いピペット処理で十分に再中断します。このペレット懸濁液を7,000 xgで、摂氏4度で10分間遠心します。
上清を捨て、粗ミトコンドリアを含むペレットを保管します。抽出した粗ミトコンドリアを再中断するために25%密度の勾配培地の12ミリリットルを加える。テキストプロトコルで概説されているように、再中断された粗ミトコンドリアを含む不連続な密度勾配を作成し、52,000 xgで遠心分離し、摂氏4度で90分間遠心します。
25%と30%の勾配媒体の間の界面で精製ミトコンドリアを収集するために長く、鈍い注射器を使用し、きれいな管に移す。採取したミトコンドリアにミトコンドリア分離バッファーを加え、3倍の体積に希釈します。15,000 xgの遠心分離機、摂氏4度で20分間。
上清を捨て、ペレットを保管します。精製ミトコンドリアを含む最終的なペレットを収集し、摂氏20度で保存します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、ミトコンドリア分離バッファーの250ミリリットルを調製する。
きれいなガラス皿に正常制御卵巣組織の約1.5グラムを加えます。2ミリリットルの前チルドミトコンドリア分離バッファーを加え、組織表面から血液を軽く洗います。この洗浄を3回繰り返します。
きれいな眼科用のはさみを使用して、組織を約1立方ミリメートルの部分に完全にミンチし、細かく組織をきれいな50ミリリットルのチューブに移します。0.05%トリプシンと20ミリモルEDTAとPBSを含む溶液を8ミリリットルを細かく制御組織に加え、室温で30分間消化して細胞を溶解し、ミトコンドリアを放出します。5分間200 xgで遠心分離機。
上清を捨て、組織と細胞を保持します。1ミリリットル当たり0.2ミリグラムの濃度でナグサルを含むミトコンドリア分離バッファーを13.5ミリリットル加え、電気ホモジナイザーを使用して4°Cでみじん切り組織を2分間均質化します。さらに3ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーを組織の均質体に加え、ピペット処理で十分に混合します。
1,300 xgで、摂氏4度で10分間ホモジュ化した組織を遠心分離する。ペレットを取り出し、上清を保持します。上清を10,000 xg、摂氏4度で10分間遠心します。
ミクロソームを含む上清を取り除き、ペレットを保持します。その後、ミトコンドリア分離バッファーを2ミリリットル加え、ペレットを軽いピペット処理で十分に再中断します。このペレット懸濁液を7,000 xgで、摂氏4度で10分間遠心します。
上清を捨て、粗ミトコンドリアを含むペレットを保管します。抽出した粗ミトコンドリアを再中断するために25%密度の勾配培地の12ミリリットルを加える。テキストプロトコルで概説されているように、粗ミトコンドリアを含む不連続な密度勾配を作成し、52,000 xgと摂氏4度で90分間遠心分離します。
長く鈍い注射器を使用して、精製されたミトコンドリアを25%と30%の勾配媒体間の界面から34%および38%の勾配媒体間の界面まで、その範囲で収集する。精製したミトコンドリアをきれいなチューブに移します。採取したミトコンドリアにミトコンドリア分離バッファーを加え、3倍の体積に希釈します。
15,000 xgで遠心分離機、摂氏4度で20分間、上清を捨てます。2ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーを加え、ペレットと遠心分離を15,000 xgで20分間摂氏4度で再中断します。上清を捨ててペレットを保管します。
最終ペレットを集めて摂氏20度で保存します。本研究では、ヒト卵巣癌および大規模定量プロテオミクスの制御組織から高品質のミトコンドリアサンプルを調製した。卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製と卵巣組織の制御には、異なる不連続な密度勾配を使用することを含むいくつかの違いがあります。
遠心分離後、卵巣癌組織からの精製ミトコンドリアは25%から30%の間の界面で見られ、対照卵巣組織のものは25%から30%の間の界面から34%から38%の間の界面までの範囲で発見され、調製されたミトコンドリアの品質は、次いで、電子顕微鏡を介して差動速度遠心分離および密度勾配遠心分離で評価される。電子顕微鏡画像は、卵巣癌と対照卵巣組織の両方において、少量のペルオキシソームを除いて、分離された主な小器官がミトコンドリアであることを示している。しかし、ミトコンドリアの形態は、卵巣組織をコントロールするよりも卵巣癌においてより多く変化することが分かる。
調製されたミトコンドリアの品質もウェスタンブロットを介して評価される。また、ウェスタンブロット画像は、卵巣癌および対照卵巣から調製されたミトコンドリアサンプルの主要成分がミトコンドリアであることを示している。ミトコンドリアはペルオキシソームと広範囲に相互作用するため、ミトコンドリアにペルオキシソームを含むのは合理的であり、これはミトコンドリアの機能的完全性を反映する。
これらの結果は、調製されたミトコンドリアサンプルの高品質を示す。私がこの手順を実行しているとき、均質化する前に組織を完全にミンチし、トリプシンを細かく制御組織に加えることを非常に重要です。また、がんサンプルとコントロールに対して不連続な密度勾配を作ったり、準備したりすることも重要です。
この手順に従って、iTRAQまたはTMT定量プロテオミクスまたはホスホプロテオミクスを実行して卵巣癌ミトコンドリアプロテオームプロファイルを明らかにし、卵巣癌におけるミトコンドリアの役割を深く明らかにするためにホスホプロテオームプロファイルを確立することができる。この技術は、研究者が卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオームおよびホスホプロテオームを体系的に研究し、シグナル経路ネットワークシステムを構築し、信頼できるバイオマーカーおよび治療対象を発見する道を開く。
