この方法の全体的な目標は、重篤な罹患率を引き起こすことなく、マウスの後肢に一貫した二次性リンパ浮腫を誘導することです。この方法は、マウスの後肢に二次リンパ浮腫を誘導するために使用することができる。この方法の主な利点は、重度の罹患率を引き起こすことなく、少なくとも8週間持続する重要でないリンパ浮腫を解決することです。
処置に新しい誰かが微小外科的技術に苦労するかもしれない。したがって、我々は、成功した結果を確保するだけでなく、彼または彼女がより効率的に手順を実行できるように研究者を準備するために、微小外科トレーニングといくつかの練習手順をお勧めします。プロトコルに記載されているように、放射線の発生源を設定し、マウスを麻酔します。
1.5ミリメートルの厚さのリードパッドを置き、手術を受けた領域のみが照射されるようにします。図示の例は、領域を明確にする術後マウスの例である。10グレイ照射の用量を投与する。
研究者は放射線を扱う際に予防措置を講じなければならない。この実験の間、全ての照射は、放射断熱室で行った。そして、放射線源は、すべての人員が部屋を出たときにのみオンになりました。
マウスの手術前の重さを量る。足または尾のピンチテストによって麻酔の深さを調べてください。手順に選択した脚を剃ります。
酸素の流れを毎分0.8リットルに設定します。ノーズコーンと接続します。眼科軟膏を適用します。
0.5ミリリットルの生理食塩水を皮下に注入し、手術中の低ボル血症を予防するためにマウスの擦り傷に好ましい。手術用布の上にマウスを置きます。鼻のコーンを鼻の上に置きます。
後肢の端をテープで優しく固定し、手術中にマウスがシフトするのを防ぎます。滑らかな鉗子で皮膚を持ち上げ、約5ミリメートル近くにある小さな開口部をポジタルフォッサにクリップします。鋭いはさみを開口部にスライドさせ、膝に向かってクリップし、切開が膝のすぐ上で終わるようにします。
クリッピング中に鉗子で皮膚を持ち上げることによって、下の血管を穿刺しないようにしてください。マウスを動かしやすい位置に移動し、円周切開を完了します。角度の上に数ミリメートルに皮膚を解剖します。
全体の手順の間に滅菌生理布地で組織を湿らせておいてください。弾性レトラクタで近位創傷の皮膚を引き込む。そして、坐骨神経静脈が示すように見えるように確認してください。
2番目と3番目のつま先の間に0.01ミリリットルの特許Blue Vを皮下に注入する。パテントブルーVを分配するために2、3回軽く足を押すと、特許ブルーVの分布は顕微鏡を通して見ることができる。可視化が必要な構造は、近位リンパ管、PLV、大窩リンパ節、PLN、第1遠位リンパ管、DLV1、および第2遠位リンパ管DLV2である。
PLVを視覚化し、10-0ナイロン縫合糸を使用してそれをリゲートするために拡大します。パテントブルーが合字に近位を渡さないことを確認するために足を押してください。図のように2つの遠位リンパ管をリゲートします。
パテントブルーVが合字に近位を通過しないように、もう一度足を数回押してください。この例では、合字がリンパの流れを妨げているためにリンパ管の1つが破裂することが分かる。このポピタルリンパ節を取り除き、リンパ節は平滑な真珠様表面を有し、周囲の脂肪組織とは対照的に特許ブルーVによって着色される。
イングイナル脂肪パッドを取り外す前に、図のようにこの容器を焼灼する。その後、脂肪パッドを1枚で取り出します。アクティブな出血がないことを確認してください。
これは、位置するリンパ節の例です。イングイナル脂肪パッドに位置するリンパ節は、特許Blue Vによって着色されることはまれであり、脂肪と区別するのが難しい場合があります。脂肪パッドを1枚で取り除くことは、リンパ節が確実に取り除かれていることを確認する最良の方法です。
皮膚の縁を筋筋膜に縫合し、鉗子と針ホルダーを使用した6-0ナイロン縫合糸を使用し、2〜3ミリメートルの隙間を残し、表面的なリンパ流を制約する。これは、完成した縫合糸の一例であり、その後肢の側側、膝の上、後肢の内側側の、大小窩の中にある。鎮痛を投与し、マウスの術後の重量を量り、回復のために加熱されたキャビネットに置きます。
手術前の照射の手順を繰り返します。このグラフは、手術後8週間の3つの別々の研究の平均後肢容積を示す。合計で31匹のマウスが含まれていた。
X軸は手術後数週間を表す。y 軸は、後肢の体積を立方ミリメートル単位で表します。矢印バーは標準偏差を表します。
手術による腫脹と誘発リンパ浮腫は、最初の4週間で減少することが予想される。最初の4週間後、リンパ浮腫の相対的な安定した状態が見られます。コントロール後肢の体積は8週間の間に増加し、したがってリンパ浮腫後肢とコントロール後肢の体積の差を厳密に言うが、これは予想外であった。
原因は、マウスが手術後数週間に手術後肢よりも非操作後肢を使用したと推測されている。これは、コントロール後肢の肥大につながる可能性があり、多分量の増加を説明.含まれる3つの研究の個々の数字については、プロトコルをお読みください。
この表は、3つの組み込み研究の体積測定値を組み合わせたシダックの多重比較検定を示しています。計算されたP値は、8週間のフォローアップの間に、誘発リンパ浮腫と対照後肢を有する後肢との間に統計的に有意な差があることを示している。含まれる3つのプロジェクトの個々の統計分析については、プロトコルをお読みください。
この方法は、統計的に有意なリンパ浮腫を誘導し、少なくとも8週間続く。この手順は、リンパ浮腫の石化性を研究し、新しい治療オプションを研究するために使用することができます。このビデオを見た後、マイクロサージャリーと手術前および手術後の照射の組み合わせを使用して、マウスの後肢に二次リンパ浮腫を誘発する方法を理解する必要があります。
一度マスターすると、外科的処置は45分で行うことができる。
