細胞外小胞分野は、細胞外小胞のタンパク質およびRNAシグナルを研究するための遺伝的に難解な無脊椎動物モデルを欠いている。このプロトコルは、C.elegansから豊富な純粋な細胞外小胞を得るための方法を確立する。これは、堅牢なRNA-SEQおよびプロテオミクス分析に十分です。
同期培養C.elegansが通常の成長培地プレートから食品を使い果たした場合は、ゴムバンドを使用して5マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターキャップを無菌ボトルに固定し、真空を開始します。L1 ワームをフィルタに注ぎ、同じ量の媒質をワーム凝集体の上に渡します。ボルテックス後、ワーム懸濁液の10マイクロリットルの3つの体積をワーム栽培プレートの蓋に移し、各ドロップ中の動物の数を数える。
新鮮な培地のマイクロリットル当たり2匹の動物にワームサスペンションを調整し、再び懸濁液を渦に入れる。次に、新しいプレート蓋に9、10マイクロリットルのワームを追加し、手動で各ドロップ内の動物の数を数えます。次に、各ワーム集団の割合として平均の平均と標準誤差を計算し、各集団の動物の総数を計算します。
分泌物生成のためのワームを準備するには、1回の洗浄あたり50マイクログラムのカルベニシリンを1皿当たり50マイクログラムで15ミリリットルの無菌M9培地に5分間洗浄してワームを洗浄し、穏やかに渦巻いてワームを取り除き、洗浄物を50ミリリットルの円錐管にプールします。最後の洗浄後、コレステロールの1ミリリットル当たり2.5マイクログラムと50マイクロモルカルベニシリン濃度を補ったS-バーゼル溶液のマイクロリットル当たり1匹の動物にワームを希釈します。その後、無菌2リットル底バッフルフラスコにワームサスペンションの最大400ミリリットルを追加します。
フラスコを20°Cの円形回転器に置き、毎分100回転を24時間置きます。細胞外小胞の収穫のために、遠心分離のために50ミリリットルの円錐形のチューブにワームを移し、0.22マイクロメートルの真空フィルターを通して上澄みをデカントして粒子状の破片を取り除きます。数えた後、一滴の浮遊ワームを細菌の芝生の上に置き、15分後に動いたり、麻痺したり、死んだりして動物を採点します。
次に、濾過した上清を再生ニトロセルロース10キロダルトン分子量カットオフフィルターで700マイクロリットルに濃縮し、150マイクロリットルの新鮮なS-バーゼル溶液を還元に加えます。結果として得られた溶液をフィルターして渦を出し、ちょうど実証したように、さらに2回減少および濾過を繰り返す。最後のろ過後、上清を遠心分離して、取り扱い中に蓄積した可能性のある粒子や破片を除去し、メーカーの指示に従ってプロテアーゼ阻害剤のカクテルとEDTAを加えます。
サイズ除外カラムを準備するために、浮遊アガロース樹脂の15ミリリットルを空の重力流カラムカートリッジにデカントする。カラムが排水したら、樹脂ベッドが最終体積10ミリリットルになるまでS-バーゼル溶液を加えます。樹脂バッファーを 40 ミリリットルの無菌濾過 S-バーゼル溶液に交換し、樹脂を乱さないで、重力がカラムを通してバッファーを排出できるようにします。
樹脂の上部が沈みなくなったら、カートリッジの底部にキャップを掛けてフローを停止し、コレクションチューブをカラムの下に置きます。分泌物分別を開始するには、キャップを取り外し、濃縮された分泌液をドロップワイズでカラムベッドの上部に追加し、続いてS-バーゼル溶液をドロップワイズで1ミリリットル添加します。カラムの下に新鮮な回収管を置き、ゆっくりとS-バーゼル溶液の5ミリリットルで上部のカラムの貯水池を充填します。
溶出物の最初の2ミリリットルを収集した後、すぐに次の4ミリリットルを収集するためにチューブを変更します。再生したニトロセルロース10キロダルトン分子量カットオフスピンフィルターを使用して、カラム溶出物を含む細胞外小胞を300マイクロリットルに濃縮し、フィルターリテンターを低結合マイクロ遠心チューブに移します。次に、1回の洗浄で20秒の渦液で100マイクロリットルのS-バーゼル溶液でフィルター膜を2回洗浄し、洗浄物を元のレテンテートと組み合わせて500マイクロリットルの最終サンプル容量を実現します。
フローサイトメトリック解析による定量のために細胞外小胞を調製するには、840マイクロリットルのS-バーゼル溶液と60マイクロリフュージチューブに精製された細胞外小胞を加える。300マイクロリットルのサンプルを2つの追加のマイクロ遠心チューブに加え、チューブあたり適切なポテンショメトリックプローブの7マイクロリットルを加えます。最後のチューブに1%トリトンX-100の7マイクロリットルを加え、渦によってすべてのチューブを混合します。
3番目のサンプルのチューブの中央に超音波装置の先端を置き、20%の電力と30%のデューティサイクルでサンプルを10回パルスします。次に、2つのコントロールマイクロ遠心チューブに300マイクロリセントのS-バーゼル溶液を加え、7マイクロリットルのプローブを染料専用チューブに加えます。2つ目のチューブに「バッファのみ」というラベルを付けます。
次に、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによる分析を行う前に、光から保護された室温で1時間すべてのチューブをインキュベートします。データを分析するには、適切なフローサイトメトリック解析ソフトウェアでファイルを開きます。小角光散乱レベルから1回の10から2〜1回の10から4つに及ぶプロットの上部から始まる長方形のゲートを設定し、イベント全体の約2.5%が含まれるまでゲートを下げます。
プローブの後にゲートに名前を付け、ゲートをコピーして他の2つのサンプルと制御データプロットに貼り付けます。次に、分析をスプレッドシートにエクスポートします。ここで、10の生物学的複製からの代表的な結果が示される。
複製間の変動は有意ではなく、母集団サイズの平均の典型的な標準的誤差は10%を少し超えるが、プレート間の動物の移動は動物の約10%の損失をもたらし、動物の約20%はスクロース浮揚段階で失われる。平均して、1,000匹の野生型の若年成動物は、10キロダルトンを超えるタンパク質の1マイクログラムを環境に分泌します。この分画がサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分離されると、全タンパク質溶出プロファイルは、2〜6ミリリットルの間の小さなタンパク質ピークと8ミリリットル後の大きなピークを示す。
細胞外小胞は、カラム溶出物の最初の5ミリリットル以内に含まれる。C.elegansとヒト細胞外小胞の間のフローサイトメトリー特性を直接比較すると、C.elegans細胞外小胞サンプルイベントのヒストグラムは、小さな角度光散乱によって分類され、すべての調製物が平均蛍光強度約10〜3倍のピークを迎えることを示している。この強力なプローブDI-8-ANEPPSは、C.elegans細胞外小胞とDI-8-ANEPPS発現によって選別された精製細胞外小胞の豊富な標識を強固に標識し、C.elegansと細胞培養由来製剤の間で有意に異ならない。
この手順で調製されたサンプルは、RNA-SEQ、フローサイトメトリー、ナノ粒子追跡分析、プロテオミクス分析など、一般的な下流細胞小胞分析方法に適しています。C.elegans細胞外小胞を精製する方法を確立することで、研究者はこの単純な無脊椎動物モデルを使用して、細胞外小胞貨物組成に影響を与える遺伝的経路および生理学的プロセスを研究することができます。
