세포 외 소포 필드는 세포 외 소포의 단백질 과 RNA 신호를 연구하기 위하여 유전으로 관해 무척추 동물 모형이 부족했습니다. 이 프로토콜은 C.elegans에서 풍부하고 순수한 세포 외 소포를 얻는 방법을 설정합니다. 이것은 강력한 RNA-SEQ 및 proteomic 분석을 위해 충분합니다.
동기화 된 배양 C.elegans가 정상 성장 중간 플레이트에서 음식을 소진했을 때 고무 밴드를 사용하여 5 마이크로 미터 나일론 메쉬 필터 캡을 멸균 병에 고정하고 진공을 시작합니다. L1 웜을 필터에 붓고 웜 골집 위에 동일한 양의 매체를 전달합니다. 소용돌이 후, 웜 서스펜션의 10마이크로리터 부피 3개를 웜 재배 판 뚜껑에 옮기고 각 낙하시동물의 수를 계산한다.
벌레 현탁액을 신선한 매체의 마이크로리터 당 두 마리의 동물로 조정하고 서스펜션을 다시 소용돌이시다. 다음으로, 새로운 플레이트 뚜껑에 벌레 를 9, 10 마이크로리터 방울을 추가하고 수동으로 각 드롭에 있는 동물의 수를 계산합니다. 그런 다음 평균의 평균 및 표준 오차를 각 웜 채우기의 백분율로 계산하고 각 집단의 총 동물 수를 계산합니다.
분비 생성을 위해 벌레를 준비하려면 세척당 카베니실린 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 멸균 M9 배지 15밀리리터에 3개의 5분 세척으로 벌레를 씻어내고 벌레를 50밀리리터 원금튜브로 풀링합니다. 마지막 세척 후, 콜레스테롤의 밀리리터 당 2.5 마이크로 그램과 50 마이크로 몰러 카베니실린 농도로 보충 S-바젤 용액의 마이크로 리터 당 하나의 동물에 벌레를 희석. 그런 다음 웜 서스펜션의 최대 400 밀리리터를 멸균 2리터 바닥 당황 플라스크에 추가합니다.
플라스크를 원형 회전에 섭씨 20도, 분당 100회 회전을 24시간 동안 배치합니다. 세포 외 소포 수확의 경우, 원심분리를 위해 50 밀리리터 원추형 튜브에 웜을 옮기고 0.22 마이크로미터 진공 필터를 통해 상류체를 감소시키고 미립자 이물질을 제거합니다. 계산 후, 세균 잔디에 중단 된 벌레한 방울을 놓고 15 분 후에 움직이는, 마비 또는 죽은 동물로 점수를 매는다.
다음으로, 재생된 니트로셀룰로오스 10킬로달톤 분자량 차단 필터를 사용하여 여과된 슈퍼티어700 마이크로리터를 농축하고 신선한 S-바젤 용액 150마이크로리터를 첨가하여 환원한다. 결과 용액을 필터링하고 소용돌이쳐 내고 방금 설명한 대로 감소 및 여과를 두 번 더 반복합니다. 마지막 여과 후, 원심 분리하여 제조 업체의 지침에 따라 처리 중에 축적 되었을 수 있는 입자와 이물질을 제거하고 프로테아제 억제제 칵테일과 EDTA를 추가합니다.
크기 배제 열을 준비하려면 중단된 아가로즈 수지 15밀리리터를 빈 중력 흐름 컬럼 카트리지로 넣습니다. 컬럼이 배수되면 수지 침대가 10 밀리리터의 최종 부피로 포장될 때까지 S-Basel 솔루션을 추가합니다. 수지 버퍼를 멸균 여과 된 S-Basel 용액의 40 밀리리터로 교체하고 수지를 방해하지 않도록 주의하고 중력이 열을 통해 버퍼를 배출할 수 있도록 합니다.
수지의 위쪽이 더 이상 물에 잠기지 않은 후 카트리지 의 바닥을 캡하여 흐름을 멈추고 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓습니다. 분비 분획을 시작하려면 캡을 제거하고 컬럼 베드 상단에 집중 된 분비 솔루션 드롭 와이즈를 즉시 추가하고 S-Basel 솔루션 드롭 와이즈의 1 밀리리터를 추가합니다. 기둥 아래에 신선한 수집 튜브를 놓고 상부 컬럼 저장소를 S-Basel 용액 5밀리리터로 천천히 채웁니다.
용액의 처음 두 밀리리터를 수집 한 후, 신속하게 다음 네 밀리리터를 수집튜브를 변경합니다. 재생된 니트로셀룰로오스 10킬로달톤 분자중량 차단 스핀 필터를 사용하여 컬럼을 함유한 세포외 소포를 300 마이크로리터로 농축하고 필터를 낮은 결합 마이크로센시립지 튜브로 전달한다. 그런 다음 세척당 20초 동안 S-바젤 용액 100마이크로리터로 필터 멤브레인을 두 번 세척하고 세척시 원래 의 레텐테이트와 결합하여 500 마이크로리터의 최종 샘플 부피를 허용합니다.
유동 세포 측정 분석에 의한 정량화를 위한 세포외 소포를 준비하려면, S-바젤 용액 840마이크로리터와 정제된 세포외 소포 60마이크로센트를 마이크로센티립식 튜브에 추가합니다. 300 마이크로리터의 마이크로리터를 2개의 추가 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 튜브당 적절한 전능성 프로브의 7개의 마이크로리터를 추가합니다. 마지막 튜브에 1%트리톤 X-100의 7개의 마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 통해 모든 튜브를 혼합합니다.
세 번째 샘플의 튜브 중앙에 초음파 처리기 팁을 놓고 20 %의 힘과 30 %의 듀티 사이클에서 샘플을 10 번 펄스. 다음으로, 2개의 제어 마이크로센심분리기 튜브에 S-Basel 용액 300마이크로리터를 추가하고 염료 전용 튜브에 7개의 마이크로리터프로브를 추가합니다. 두 번째 튜브 버퍼에만 레이블을 지정합니다.
그런 다음 표준 프로토콜에 따라 순환 측정을 유동하기 전에 빛으로부터 보호되는 실온에서 모든 튜브를 1시간 동안 배양합니다. 데이터를 분석하려면 적절한 흐름 사이토메트릭 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 작은 각도 조명 산란 레벨에서 1회 10회에서 10회에서 4회까지 의 작은 각도 조명 산란 레벨에서 시작하여 총 이벤트의 약 2.5%가 포함될 때까지 게이트를 아래로 가져오는 직사각형 게이트를 설정합니다.
프로브 후 게이트이름을 지정하고 게이트를 복사하여 다른 두 샘플 및 제어 데이터 플롯에 붙여 넣습니다. 그런 다음 분석을 스프레드시트로 내보냅니다. 여기서, 10개의 생물학적 복제로부터의 대표적인 결과가 나타난다.
복제 사이의 가변성은 중요하지 않으며 인구 크기의 평균의 전형적인 표준 오차는 10% 조금 이상이며, 접시 사이의 동물의 이송은 동물의 약 10%의 손실을 초래하며, 동물의 약 20%는 자당 부양 단계에서 손실됩니다. 평균적으로, 1, 000 야생 형 젊은 성인 동물은 그들의 환경에 10 킬로톤 보다 큰 단백질의 1 마이크로 그램을 분비합니다. 이 분획이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 더 분리될 때, 총 단백질 용출 프로파일은 8 밀리리터 후에 2-6 밀리리터 와 큰 피크 사이 작은 단백질 피크를 보여줍니다.
세포 외 소포는 열 용해의 처음 5 밀리리터 내에 포함되어 있습니다. C.elegans와 인간 세포 외 소포 사이의 유동 세포 측정 특성의 직접 비교에서, 작은 각도 광 산란에 의해 정렬 된 C.elegans 세포 외 소포 샘플 이벤트의 조직사진은 모든 준비가 약 10 ~3 분의 1의 평균 형광 강도에서 피크를 나타낸다. 전능성 프로브 DI-8-ANEPPS, 강력하게 C.elegans 세포외 소포및 DI-8-ANEPPS 발현에 의해 정렬된 정제된 세포외 소포의 풍부를 강하게 라벨은 C.elegans와 세포 배양 유래 제제 사이에서 크게 다르지 않다.
이 절차에 의해 제조된 견본은 RNA-SEQ, 유동 세포측정, 나노 입자 추적 분석 및 proteomic 분석을 포함하여 모든 전형적인 다운스트림 세포외 소포 분석 방법에 대한 순종적입니다. C.elegans 세포 외 소포를 정화하는 방법을 수립하면 연구원은 이 간단한 무척추 동물 모델을 사용하여 세포외 소포 화물 조성에 영향을 미치는 유전 적 경로 및 생리적 과정을 연구 할 수 있습니다.
