このプロトコルは、下流の元生体分析のために組織全体の標本から小さな細胞外小胞を抽出および分離するための厳格で再現可能な技術を提供します。現在達成可能な最高レベルの純度の中で、この方法は腫瘍を含む様々な組織標本に分泌される間質性小胞の直接的形態学的、免疫性の特徴、および深い特徴付けを促進する。ここでは、脳および肺腫瘍標本からの組織EVの分離を実証する。
しかし、この技術は、多様な、良性、または他の腫瘍標本を用いた研究にも適用することができる。まず、Hibernate-E培地で、0.4〜1.0グラムの組織ごとに10ミリリットルの解離バッファーを調製します。50ミリリットルチューブのバッファーに新鮮または凍結した組織全体を追加し、20分間摂氏37度の温水浴でインキュベートします。
この後、解離緩衝液中の最終的な1倍濃度に対するプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加する。ティッシュと溶液をホモジナイザーを緩いフィットダウンに注ぎます。サンプルあたり約30の遅いストロークを使用して、組織を穏やかに解約します。
次いで、解約組織と緩衝液を50ミリリットル円錐形チューブに移す。500x gで遠心分離機を5分間摂氏4度で、細胞と残りの繊維または凝集組織断片をペレットする。上清をきれいな50ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を2,000x gで、摂氏4度で10分間ペレットにして大きな細胞破片を捨てます。
この上清をきれいな50ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を10,000x gで40分間摂氏40分間移し、望ましくない大きな小胞または小さなアポトーシス体をペレットにします。0.45マイクロメートルフィルターを通して上澄みをきれいな12ミリリットルの超遠心チューブにデカントします。次に、サンプルを100,000x gで、摂氏4度で2時間超遠心分離し、小さなEVをペレットにする。
上清をデカントし、超遠心チューブを5〜10分間反転させ、頻繁にタップしてチューブの側面に残留液を取り除きます。その後、EVペレットを0.25モルショ糖緩衝液の1.5ミリリットルに再懸濁する。パラフィルムでチューブを覆い、その後、EVを溶液に渦を出します。
超遠心管を室温で10~15分揺らす。そして、もう一度渦。チューブの下部にある液体懸濁液を回収するために、1,000x g未満の速度でチューブを短く遠心分離します。
必要に応じて、一晩で摂氏4度で保管してください。まず、60%イオデキサノールの1.5ミリリットルを、EVを含むスクローストリスバッファーの1.5ミリリットルに加え、30%イオデキサノールを含む最終的な溶液を作成します。ピペットは数回上下して溶液を完全に混合する。
この溶液を5.5ミリリットルの超遠心チューブの底に移します。次に、60%のiodiキサノールストックと超純水を混ぜ、20%と10%の両方の溶液を調製します。注射器と18ゲージ針を使用して、20%iodiキサノール溶液の1.3ミリリットルを測定し、慎重に底の勾配の上に重ねます。
針のベベルをチューブの内側と接触させ、メニスカスのすぐ上に置き、密度インターフェイスで層を混合しないように溶液をドロップする必要があります。次いで、10%のiodiキサノール溶液の層1.2ミリリットルを20%層の上に、同じ技術を用いた。慎重にバランスをとり、ローターバケットに超遠心チューブをロードします。
スイングバケットローターの加速と減速速度を最低速度に、遠心分離機を268,000x g、摂氏4度に50分間設定します。サンプルが遠心分離されている間、密度勾配の1から10の分数に対応する各サンプルのラベル10 1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管。遠心分離が完了したら、ローターバケットからチューブをそっと取り出し、安定したホルダーに入れます。
ピペット10の490マイクロリットルのシリアル分画は、勾配の上部から対応するチューブに入った。屈折計を使用して、分数の屈折率を測定する。次いで、各分画をクリーン12ミリリットルの超遠心チューブに移す。
各チューブに1x PBSの5ミリリットルを加え、ピペットをゆっくりと上下に加え、混ぜます。チューブの上部に1x PBSの追加6ミリリットルを追加し、慎重に再び混ぜます。100,000x gで、摂氏4度でチューブを超遠心分離し、小さな小胞を再ペレットします。
上清をデカントし、タンパク質分析のために小胞をライシングする前にチューブを乾燥させたり、形態解析のためにEVを再懸濁させます。タンパク質分析のためにEVを分解するには、プロテアーゼ阻害剤を含む強力なリシスバッファーの40マイクロリットルをEVペレットに加えます。パラフィルムを各チューブの上に置き、渦を激しくする。
次に、室温で20分間チューブを揺らし、再び渦を起させます。サンプルを1,000x gで30~60秒間短遠分化し、サンプルボリューム全体を回収する。各サンプルを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、さらに処理できるようになるまで20~80°Cの温度で保管します。
精製したライセートを免疫ブロット分析用に調製するには、5xレムリサンプルバッファーをサンプルに加えて、最終濃度の1xを得ます。サンプルを摂氏95度で5~10分煮ます。次に、1 から 10 の等量の分数を 10% SDS ページゲルにロードします。
均質な組織の等しい質量をロードする。精製したライゼート中のEVタンパク質を確認し、相対EVの比率を比較するために、電気泳動とウェスタンブロット分析を行います。本研究では、細胞外小胞を抽出し、組織全体から精製する。
10~30%のiodiキサノール勾配の超遠心化の後、光EVの集団は2分の2まで移動し、密集したEVの集団は組織の種類に応じて5分の5まで移動するのを見ることができます。この勾配画分の代表的な免疫ブロットは、小さな腫瘍由来のEVを分数5で効率的に分離および精製することを示す。特に、肺腫瘍標本は、以前に脳組織全体から採取された光EVと比較して、密集したEVで濃縮されているように見える。
代表的なナノ粒子追跡分析と分数を含む主要な小胞中の組織由来小胞の電子顕微鏡検査は、小胞全体の濃縮および保存を示す。小さなEVの既知のサイズと構造と一致しています。インタースティシャルEVは、新しい診断または予後バイオマーカーアッセイの開発のための有望なターゲットを表します。
この技術は、下流の有用性のための小胞の抽出と精製のためのツールを研究者に提供します。全体またはリズされた組織のEVの抽出後、プロテオーム、ゲノム、およびリピドミック分析を含む小胞の広範な特徴付けが行われ得る。さらに、サンプルは、よりターゲットを絞ったアプローチに使用することができます。
組織標本から直接分離された小胞は、腫瘍の起源を含む疾患メカニズムに関するさらなる洞察を提供することができ、将来的に重要な診断または予後のツールを提供する可能性があります。
