サイズ排除クロマトグラフィーは、異種サイズの細菌小胞の亜集団を分離し、細菌の上清から核酸やタンパク質を除去するのに有用なアプローチです。サイズ排除クロマトグラフィーは、密度勾配超遠心分離を含む他の分離技術よりも安価で、速く、より再現性が高い。我々は、A.actinoceteomitomitans小胞を使用してこのアプローチの可能性を実証したが、我々はそれが同様に他の異種サイズの細菌小胞集団にも適用することができることを期待している。
すべてのバッファーとビーズ溶液を適切に脱気し、気泡を導入することなく溶液をゆっくりとピペット化し、ビーズが乾燥することなく均質にパックするほど迅速に行ってください。まず、ガラス棒を使用してゲル濾過媒体のストックボトルを混合し、カラムに約50%の過剰を充填するために必要な体積をガラス瓶に注ぎます。ビーズが沈着し、余分な液体をデカントできるようにします。
溶出バッファー内のビーズを約 70%ゲルおよび 30%緩衝液の最終溶液に再懸濁し、真空下で溶液を脱気します。柱を垂直位置のリングスタンドに取り付け、約1センチメートルしか残らなくなるまで緩衝材を排出する前に、壁を濡らす溶出バッファでカラムを埋めます。その後、ゲルビーズを慎重にピペットでカラムに入れ、余分なバッファーを排出すると同時に、カラムがカラムリザーバーの底から約2センチメートル下の高さまで詰まるまでビーズが沈降するのを防ぎます。
サンプルをロードする前に、真空下で溶出バッファーを脱気します。溶出バッファーの約 2 倍のカラム体積でカラムを洗浄します。バッファーがゲル層の上部に到達したら、表面を乱すことなくゲル層の上に1リットル当たり100〜200ナノモルのナノモルサンプルを慎重に2ミリリットル加え、サンプルをゲルに入れます。
ゲル層を乱さずに緩やかに溶出バッファーをカラムに加え、カラムの下に50ミリリットルのチューブを置きます。カラムが乾燥するのを防ぐために、同時にカラムの上部に溶出バッファーを追加します。溶出物を20ミリリットル回収した後、カラムの下に1.5ミリリットルのチューブのラックを置きます。
各チューブに合計96個の1ミリリットル分を集める。サンプルを収集しながら、連続的にカラムに溶出バッファーを追加します。カラムをクリーニングするには、1カラムの水酸化ナトリウムモルを1列ずつ実行し、その後に2列の溶出バッファーを使用します。
脂質濃度を測定するために、各分画のピペット50マイクロリットルを96ウェルプレートに入した。各ウェルに2.5マイクロリットルの脂溶性染料を加えます。15秒後、蛍光強度を測定する。
目的のタンパク質の濃度を測定するには、ELISA免疫プレートの個々のウェルに各画分の100マイクロリットルを追加します。摂氏25度で3時間後、プレートの内容物をデカントします。洗浄ごとに200マイクロリットルのELISA洗浄バッファーでプレートを5回洗浄し、洗浄後にプレートをデカンタンします。
25°Cで1時間のインキュベーションのために各井戸に200マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。インキュベーションの終わりに、プレートをデカントし、摂氏4度で一晩インキュベーションのためのブロッキングバッファーに一次抗体の100マイクロリットルを追加します。翌日、プレートをデカントし、実証したようにELISA洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
最後の洗浄後、ELISA洗浄バッファーに100マイクロリットルの二次抗体を加え、摂氏25度で1時間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、実例のようにプレートを洗浄し、室温で15〜30分間インキュベーションするために各ウェルに100マイクロリットルのTMB溶液を加えます。青い色が現れたとき、各ウェルに50マイクロリットルの止止め液を加え、450ナノメートルで吸光度を測定します。
A.アクチノミセテミタンの培養上清のサイズ排除カラム精製が実証された後、この株によって産生される大小の外膜小胞に対応する2つの異なる脂質ピークが観察された。サンプル画分のELISA分析は、毒素が主に大きな外膜小胞のサブ集団に関連していることを明らかにした。免疫ブロット分析は、同様であるが、より騒がしい結果を与え、このアプローチはELISAよりも感度が低いことを示した。
観察されるように、このクロマトグラフィー技術は、外膜小胞の調製物からかなりの量の遊離タンパク質を除去することができる。しかし、全タンパク質濃度が特定のタンパク質の濃度と必ずしも相関しないことに注意することが重要です。気泡を避け、カラムが乾燥するのを防ぐために、柱の梱包と走行中に非常に注意することが重要です。
動的光散乱、粒子追跡、および二頭鏡検査は、分離された外膜小胞のサイズおよび他の特性を決定するために、以下のサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる。
