アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

このプロトコルは、DMD分野で信頼性の高い結果を得るために重要である前臨床設定および臨床試験で筋肉組織を調製し、処理するための標準化された方法論を提供する。このテクニックは、DMD の試行をスキップする場合に関連しています。そして、主な利点は、それらが十分に確立され、まとめて行われれば再現可能であるということです。

これらの技術は主にDMDでのエキソンスキップに焦点を当てていますが、プライマーの変更により、スプライシング療法で治療される他の疾患にも同じ技術を適用できます。これらの方法は、エキソンスキップ効率とRNAおよびタンパク質の両方を達成するために使用することができる。分析用のサンプルを調製するには、まず、ガムが柔らかく粘着性になるまで、トラガカンスガムと水の等量を混合します。

この混合物を25ミリリットルのシリンジにロードし、0.5〜1センチメートルのガムを個々のコルクディスクに分配します。反対側にディスクにラベルを付け、液体の一部が凍結するまで液体窒素にイポランタンの容器を置きます。各標本を、コルクに対して垂直な各筋肉の縦軸を持つディスク上のトラガカンスガムに入れる。

各筋肉の底にガムを置いて筋肉を所定の位置に保持し、ピンセットを使用して冷たいイセペンタンの標本を凍結します。試料を1分間連続的に移動するか、完全に凍結するまで、一時的にドライアイスに置きます。その後、標本をガラスバイアルに入れ、摂氏80度の貯蔵を行います。

分析のために凍結した筋肉組織を切り離すために、クライオスタットを25°Cの作動温度に設定し、筋肉ブロックをホルダーに取り付けます。平らな切片が達成されるまで組織ブロックをトリミングします。逆転写PCRおよびウェスタンブロット分析では、厚さ10マイクロメートルのスライスを得る。

免疫体化学分析のために、6〜8マイクロメートルの厚いスライスを得て、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、10〜12マイクロメートルの厚いスライスを得る。獲得後、スライスした切片を2本のミリリットルチューブに入れる。PCRおよびウェスタンブロッティングのサンプルを摂氏80度で保存してください。

ここで、マイクロチップ電気泳動システムは、逆転写酵素PCR反応のゲル画像、および用量エスカレーションフェーズ1でアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置前後の2人の患者からのスキップされたバンドのシーケンシング結果を示す。両方の患者は、削除を抱えています。予想通り、治療前に、両方の患者はスキップを示さなかったし、唯一のスキップされていないバンドを視覚化することができた。

12週間の治療の後、2番目の患者のために明確にスキップされた下のバンドを視覚化したが、第1の患者に対して任意のスキップされた製品を検出することは依然として困難であった。シーケンシング結果は、第2の患者に対してエキソン47と54、および第1の患者に対してエキソン44と54の連結を示した。スキップされたパーセンテージを計算するために、スキップされたバンドのモル濃度をスキップバンドとスキップされていないバンドで割った値です。

予想通り、治療前にウェスタンブロットによってジストロフィンバンドが検出されなかった。治療後、健常性コントロールで観察されたものと比較して、分子量が低い第2の患者からバンドを検出した。しかし、最初の患者は、治療後に検出可能なレベルのジストロフィンを示さなかった。

筋肉組織を正しく処理し、各標本をトラガカンスガムに一貫した方法で配置することが重要です。組織切片は、人工PCR、デジタルPCR、ウェスタンブロット、免疫組織化学、および異なるタイプのオミクスを含む多くの異なる方法で分析することができます。これらの技術は、加速することができ、開発、異なるエキソンを標的とする薬物をスキップする追加のエキソン、およびDMDの編集においてウイルスベースの開発に再び適用することができる。