黄色ブドウ球菌は、病因を促進する広範囲の毒性因子を産生するグラム陽性細菌である。これらには、PMNまたは好中球とも呼ばれる多形核白血球の膜完全性を破壊する二成分ロイコトキシンが含まれる。このビデオは、ヒト全血からのPMNの分離と、これらの重要な自然免疫細胞に対するS.aureus細胞毒性を定量化するための2つの異なるアッセイを示しています。
これらのアッセイはすべて標準的な実験室装置によって達成され、宿主病原体の相互作用の他の側面を調べるために容易に適応可能である。これらの実験は、ヒトドナーから引き出された全血を使用し、適切な機関委員会または審査委員会からの承認と、すべての参加者からインフォームド・コンセントが得られたという声明を必要とする。この手順の最初のステップは、遠心分離と密度勾配の使用による好中球の分離です。
まず、50ミリリットルの3%デキストラン0.9%塩化ナトリウム、0.9%塩化ナトリウム35ミリリットル、塩化ナトリウム1.8%の20ミリリットル、ミリリットルのフィコール溶液あたり1.077グラムの12ミリリットル、水20ミリリットルを室温に持ち込みます。25ミリリットルのヘパリン化されたヘパリン化されたヘパリン化された血液を2本の円錐形遠心管に移す。25ミリリットルのヘパリン化したばかりの全血と25ミリリットルの室温、3%デキストラン、0.9%の塩化ナトリウムを1対1の比率で組み合わせます。
50ミリリットルの円錐管を軽く揺らし、室温で30分間静かに動かします。室温でインキュベーションした後、2つの別々の層が現れます。各デキストラン血液混合物の最上層を新しい50ミリリットル円錐形チューブに移す。
450 gで450 gの遠心分離機を室温で10分間、低いか、または無断で休憩します。慎重に上清の両方を吸引し、細胞ペレットを乱すことなく廃棄します。各細胞ペレットを0.9%塩化ナトリウムの2ミリリットルに静かに再懸濁します。
再懸濁されたペレットを1つの50ミリリットルの円錐に組み合わせ、残りの0.9%塩化ナトリウムを35ミリリットルの最終体積に加えます。ハンドピペットを使用して、細胞懸濁液の下に1ミリリットル当たり1.077グラムの慎重に下敷き。室温で30分間450gで紡糸した後、低いか無く断裂して、先に示したように細胞ペレットを邪魔することなく上清を穏やかに吸引する。
細胞ペレットを室温水20ミリリットルに再懸濁して赤血球をライセする。30秒間揺らすことでやさしく混ぜます。室温で10分間450gで1.8%塩化ナトリウムと遠心分離機サンプルの20ミリリットルをすぐに加えます。
前に示すように慎重に吸引上清。細胞ペレットを2ミリリットルの室温RPMIで静かに再懸濁し、氷の上に置きます。マカチメーターを使用して細胞を数えます。
精製したPMNを氷冷RPMIで10~7番目の細胞/ミリリットルの1倍の濃度で再懸濁し、氷の上に置きます。精製PMNの100マイクロリットルを300マイクロリットルのDPBSと組み合わせ、2つの複製フローサイトメトリーチューブに1マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色を含みます。ポジティブコントロールのために、フローサイトメトリーチューブの1つに0.5%トリトンX-100溶液の40マイクロリットルを加え、十分に混合します。
フローサイトメトリーを使用して、前方散乱、側面散乱、ヨウ化プロピジウム染色を測定し、単離されたPMNの純度と完全性を決定します。98%を超え、95%以上のヨウ化プロピジウム陰性のPMN製剤のみを使用すべきである。通常のヒト血清の単離を概説するプロトコルについては、完全な原稿を参照してください。
このアッセイで使用される個々のウェルにDPBSで希釈した20%単離されたヒト血清の100マイクロリットルを加えることによってPMN細胞傷害アッセイのための96ウェルプレートを準備する。メディアのみを受け取る少なくとも1つの否定的なコントロールと、0.05%Triton X.Incubate 37°Cでプレートを30分間摂氏37度で受け取る少なくとも1つの肯定的なコントロールウェルを含むようにしてください。インキュベーションに続いて、コード化された井戸を100マイクロリットルの氷冷DPBSで2回洗浄し、氷の上にプレートを置きます。
プレートウェルから残留DPBSを取り除き、10倍の10マイクロリットルの精製ヒトPMNを、コード化された各1ミリリットル当たり7番目の細胞に穏やかに加えます。メッキされた好中球を氷の上に少なくとも5分間放置してから、以下の細胞傷害性アッセイで使用してください。このセクションでは、ヒトPMNに対してホウレウスによって産生される細胞外タンパク質の細胞毒性を定量化するアッセイについて説明します。
培養S.アウレウスは、実験の前日に摂氏37度に設定された振れインキュベーターを用いて適切な培地で一晩培養する。亜培養S.aureusは、新鮮な培地で一晩細菌培養物の1〜100希釈を行うことにより。細菌が早期の静止成長段階に達するまで揺れで摂氏37度でインキュベートする。
5時間の成長の後、サブカルチャーS.aureusの1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離機を室温で5分間5,000gで送ります。遠心分離後、吸気上清。0.22ミクロンのシリンジフィルターを通して吸気した上澄み物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに渡し、氷の上に置きます。
シュタウレアスの培養に使用される氷冷培地で上清の連続希釈を行う。前述のように、氷上のPMNを含む96ウェルプレートの個々の井戸に、負と陽性のコントロールのために貸し出された上澄みサンプルまたはメディアをそっと追加します。優しく岩板を井戸に上澄み物を分配し、摂氏37度でインキュベートする。
所望の時に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。各フローサイトメトリーチューブにヨウ化プロピジウム1マイクロリットルを含む氷冷DPBSの300マイクロリットルを加えます。サンプルを氷上のサイトメトリーチューブを流すために移します。
陽性対照のために、フローサイトメトリーチューブに移す前に、サンプルに10%トリトンXの20マイクロリットルを加えます。フローサイトメトリーを用いて、酔っ払ったPMNのヨウ化プロピジウム染色を解析する。このセクションでは、ヒトPMNによる貪食後のS.aureusの細胞毒性を定量化するアッセイについて説明する。
600ナノメートルの光学密度と細菌の濃度によって定義される成長曲線は、このアッセイで使用する前に関連するステープルアウレウス株について決定されなければならない。前述のように、S.アウレウス株および亜培養細菌の一晩培養を開始する。亜培養されたステープルアウレウスが中指数成長に達したら、培養細菌の1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、遠心分離機を室温で5分間5,000gで送り込みます。
ペレットを乱さずに上清を吸引してS.aureusを洗浄し、ペレット化された細菌を1ミリリットルDPBSで再懸濁する。30秒間サンプルを渦出します。試料を室温で5分間5,000gで遠心分離する。
黄色ブドウ球菌を酸化するために、まず20%ヒト血清中の1ミリリットルで細菌ペレットを再懸濁する。その後、15分間攪拌して摂氏37度でサンプルをインキュベートします。前に示したように遠心分離後に酸化された黄色ブドウ球体を洗浄する。
希薄化された黄色ブドウ球菌株は、10〜8番目のコロニー形成単位、1ミリリットル当たりのCFUs、氷冷RPMIを有する。30秒間サンプルを渦し、氷の上に置きます。これらのアッセイに使用される黄色ブドウ球菌の濃度を確認するには、寒天上の細菌の1~10の連続希釈液をめっきして確認します。
ステップ1.14から氷上の96ウェルプレートのPMNに、各ステープルアウレウス株のウェルあたり100マイクロリットル、または正と負のコントロールのためのRPMIを穏やかに加えます。静かに岩板は、ウェルにステープルアウレウスを分配します。摂氏4度で8分間500gの遠心板で食肉食症を同期させ、遠心分離直後に摂氏37度でインキュベートプレートを時間ゼロにします。
所望の時点で、氷の上にプレートを置き、各フローサイトメトリーチューブに1マイクロリットルヨウ化プロピジウムを含む氷冷DPBSの200マイクロリットルを追加し、対応するチューブにサンプルを転送します。2.8および2.9に記載されているようにフローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色のサンプルを分析する。ステープルアウレウスによってヒトPMNを標的とする2成分ロイコトキシンの転写には、SAまたはS2成分システムがヒトPMNに対するステープル・アウレウス細胞毒性を定量化するための記述されたアッセイの有用性を実証する必要がある。
これらの実験は、この株においてSAまたはSのソロ原性欠失変異体においてUSA300として同定された臨床的に関連するステープル・アウレウス分離株で行った。左側のパネルは精製されたPMNを示し、右側のパネルは意図的に汚染されたサンプルを例として描写しています。このプロトコルのセクション1で説明した手順を用いて分離されたPMNをヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーを用いて調べた。
フォワードおよびサイド散乱プロットは、1Aおよび1B年の単球またはリンパ球による精製PMNの汚染を検出するために使用された。ヒトPMN精製の記載の方法を用いることによって、98%純粋で95%以上のヨウ化プロピジウム陰性である8番目のPMNに10〜10倍の5倍の10から1回を一貫して分離することができる。
USA300およびAsaeR/S変異体によって産生された細胞外タンパク質の細胞毒性を、精製PMNに対して試験した。これらの実験は、USA300によって産生された細胞外タンパク質による30分間の中毒後の精製PMNのプロピジウムヨウ化物染色の濃度依存性の増加を示すが、AsaeR/S変異体では得られていない。さらなる実験は、約30分後に高原したUSA300細胞外タンパク質による中毒に続くヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合の着実な増加を示した。
ヒトPMNのヨウ化プロピジウム染色は、AsaeR/S変異体によって産生される細胞外タンパク質への暴露後のすべての時点で注目された。最後に、同期食作用後のPMNに対するUSA300およびAsaeR/S変異体の細胞毒性が試験された、USA300の貪食後90分のプロピジウムヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合の濃度依存性の増加が観察された。AsaeR/S変異体の貪食症に続く陽酸プロピジウム陽性のPMNは有意に少なかった。
これらの実験のそれぞれでUSA300およびAsaeR/S変異型接種の列挙体は、これらの株間の細胞毒性のコントラストは、使用される細菌の濃度の違いによるものではないことを示した。このプロトコルは、これらの自然免疫細胞に対するS.aureusの細胞毒性を定量化するための2つの異なる技術におけるヒト血液からのPMNの精製を記述する。これらの手順の成功は、精製されたPMNの品質とステープルアウレウス細菌または上清の適切な調製に依存します。
これらの手順を実行する際に考慮すべき重要な点については、原稿全文をご参照ください。USA300は毒性のMRSA単離であり、AsaeR/Sの損失は、ヒトPMNを標的とする毒性因子の転写を劇的に減少させ、これらの株は記述されたアッセイを用いて細胞毒性を比較するための理想的なモデルを作る。成長条件、添加される上清の量、またはPmNに対する細菌の比率を調整することは、黄色いアウレウスの他の株を使用する場合に必要とされる場合があります。
