ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化

白飛球のウイルスの空間性と量を明らかにすることは、ベゴモウイルスと白飛の相互作用を理解し、重篤なベゴモウイルス疾患を制御するための新しい戦略の開発に役立ちます。この技術の利点は、ホワイトフライ組織を迅速に分離し、ウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共にローカライズし、ホワイトフライ全身およびウイルス感染植物のウイルスを定量化できることです。適切な実験時点で、ウイルス取得後、氷を麻酔した雌の白身エを顕微鏡スライド上のPBSの滴に入れ、細かい鍼針を使用して、ステレオ顕微鏡下で白ホフライの腹部を開く。

注射針を使用して中腸を抽出し、中腸をPBSのコレクション皿に入れます。PSGを収集するには、頭の近くの後側から胸郭で体を分割し、胸郭を通して針でホワイトフライを固定します。2つの唾液腺が体から分離されるまでホワイトフライを振り、PBSの新しい皿に腺を移すために2番目の針を使用してください。

卵巣を採取するには、腹部を完全に開き、針を使って卵巣を他の組織から分離する。余分な組織を除去し、PBSの新しい皿に卵巣を移すためにピペットを使用してください。溶水サンプルを採取するには、10マイクロリットルのPBSを新しい顕微鏡スライドに加え、新しいホワイトフライを液滴に入れる。

細かい鍼針を使って腹部に穴を開けます。その後、腹部にわずかな圧力を加え、ヘモリンパを緩衝液に放出し、液体の8マイクロリットルのサンプルを採取する。収穫されたホワイトフライPSG、ミドグ、または卵巣組織におけるTYLCV局在化を可視化するには、15〜20個の標本をガラス3.5センチメートルのペトリ皿に移し、余分な緩衝液を吸引する。

1回の洗浄ごとに新鮮な結核の1ミリリットルでサンプルを2分間2分間慎重に洗浄する前に、室温で2時間4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルで組織を固定します。最後の洗浄後、1回の洗浄につき1ミリリットルのTBSTで実証したように、3回洗浄する前に30分間0.5%トリトンX-100の1ミリリットルでサンプルを透過させます。最後の洗浄後、1%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルを室温で2時間、続いてTBSTで3回の洗浄を行い、非特異的結合をブロックします。

最後の洗浄後、細胞に一次抗体を一晩で光から保護した摂氏4度で標識します。翌朝、サンプルをTBSTで3回洗浄してから、適切な二次抗体を光から保護された室温で2時間添加します。インキュベーションの終わりに、中腸を3回洗い、標本をきれいな顕微鏡スライドに移します。

できるだけ多くのバッファーを取り出し、カバースリップで取り付け、共焦点顕微鏡で標識された組織を調べる前に、DAPIの1滴で核を染色します。TYLCV定量の場合、採取したホワイトフライ組織サンプルを新鮮なPBSで2〜3回洗浄し、25マイクロリットルの溶解溶液を含む個々のPCRチューブにPBSの5マイクロリットルで20ミドグ、20 PSG、または1つの卵巣を移します。各チューブに直径2ミリメートルのセラミックビーズを5~7個加え、ホモジナイザーでサンプルを粉砕します。

新しいPCRチューブに8マイクロリットルのヘモリンパサンプルを1つ加え、10マイクロリットルのライシスをチューブに完全に混合します。すべてのサンプルを摂氏65度で1時間インキュベートし、続いて摂氏100度で10分間のインキュベーションを行い、短い遠心分離を行います。次に、定量PCRストリップチューブのバイアルに18マイクロリットルのマスターミックスを加え、各DNAサンプルの2マイクロリットルを少なくとも3つのバイアルに加えます。

すべてのサンプルがロードされたら、チューブと遠心分離機を閉じて、各バイアルの底部に溶液を沈めます。バイアルを定量PCR用のリアルタイムサーマルサイクラーにロードし、フッ素色素としてサイバーを選択し、サンプルタイプとして不明です。次に、定量データをスプレッドシートにエクスポートして、各サンプル内のウイルスDNAの相対量を分析します。

ここでは、ホワイトフライPSG、中腸、卵巣におけるDAPI染色におけるTYLCVの代表的な画像が示されている。観察されるように、TVLCVは卵巣よりもPSGおよび中腸内でより大きな蓄積を示す。TYLCV感染トマトを24時間、48時間、72時間食べた後のホワイトフライPSG、中腸、ヘモリンフ、卵巣におけるウイルスの定量化は、取得アクセス期間の増加と直接相関して異なる白飛組織のウイルス量が増加することを示している。

死んだ昆虫は解剖の難しさを増すので、新鮮なホタルを使用するのが最善です。この手順に従って、他の分析は、ウェスタンブロッティングおよび共免疫沈降法のような、ウイルスタンパク質発現およびウイルスおよびベクタータンパク質相互作用に関する追加の質問に答えるために行うことができる。