백색 파리 벡터에서 바이러스의 공간성과 양을 명확히하는 것은 begomovirus-whitefly 상호 작용을 이해하고 심각한 begomoviral 질병을 통제하기위한 새로운 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 화이트플라이 조직을 신속하게 분리하고, 바이러스 및 백색 도단백질을 공동 으로 국한하며, 백색 파리 전신 및 바이러스감염 식물의 바이러스를 정량화할 수 있다는 것입니다. 적절한 실험 시점에서, 바이러스 획득 후, 현미경 슬라이드에 PBS의 방울에 얼음 마취 여성 흰파리를 배치하고 스테레오 현미경에서 백색 파리의 복부를 열기 위해 미세 침술 바늘을 사용합니다.
바늘을 사용하여 미드구트를 추출하고 MIDgut를 PBS컬렉션 접시에 넣습니다. PSG를 수집하려면 머리 근처의 등쪽에서 흉부에서 몸을 분할하고 흉부를 통해 바늘로 백색 도면을 고정합니다. 두 번째 바늘을 사용하여 두 타액 선이 몸에서 분리 될 때까지 백색 도선을 흔들고 땀샘을 PBS의 새로운 접시로 옮긴다.
난소를 수집하려면 복부를 완전히 열고 바늘을 사용하여 난소를 다른 조직으로부터 분리하십시오. 파이펫을 사용하여 과도한 조직을 제거하고 난소를 PBS의 새로운 접시로 옮기는다. 혈청량 샘플을 수집하려면 새로운 현미경 슬라이드에 PBS 10 마이크로리터를 추가하고 새로운 백색 도면을 액적에 넣습니다.
미세침술 바늘을 사용하여 복부에 구멍을 부드럽게 만듭니다. 그런 다음 복부에 약간의 압력을 가하여 혈류를 완충제로 방출하고 액체의 8개의 마이크로리터 샘플을 수집합니다. 수확된 화이트플라이 PSG, 미드구트 또는 난소 조직에서 TYLCV 현지화를 시각화하려면 15~20개의 표본을 3.5센티미터 페트리 접시에 옮기고 과잉 버퍼를 흡인시합니다.
정산용 시료를 세척당 1밀리리터에서 2분 동안 3회 세 번 세척하기 전에 실온에서 2시간 동안 4%의 파라포름알데히드1밀리리터로 티슈를 수정합니다. 마지막 세척 후, 세척 당 TBST의 1 밀리리터로 입증 된 것처럼 세 번 세척하기 전에 30 분 동안 0.5 %의 Triton X-100의 1 밀리리터로 샘플을 permeabilize하십시오. 마지막 세척 후, 실온에서 2시간 동안 1%소 세럼 알부민 1밀리리터로 비특이적 결합을 차단한 다음 TBST에서 3개의 세척을 시연합니다.
마지막 세척 후, 빛으로부터 보호 섭씨 4도에서 하룻밤 관심의 주요 항체로 세포를 레이블. 다음 날 아침, TBST로 샘플을 세 번 세척한 후 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 적절한 이차 항체를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 중간구스를 세 번 씻고 시편을 깨끗한 현미경 슬라이드로 옮겨보십시오.
가능한 한 많은 버퍼를 제거하고 커버 슬립으로 장착하고 공초점 현미경 검사에 의해 표지 된 조직을 검사하기 전에 DAPI의 한 방울로 핵을 얼룩. TYLCV 정량화를 위해, 수확된 백색파리 조직 샘플을 신선한 PBS에서 2~3회 세척하고 PBS의 5개의 마이크로리터에서 20개의 midguts, 20 PSG 또는 1개의 난소를 용해 용액25마이크로리터를 포함하는 개별 PCR 튜브로 이송한다. 각 튜브에 직경 5~7밀리미터 의 세라믹 구슬을 추가하고 균질화로 샘플을 갈아냅니다.
새로운 PCR 튜브에 혈몰리프 의 8 마이크로 리터 샘플을 추가하고 철저한 혼합튜브에 10 마이크로 리터의 리시스를 추가합니다. 모든 샘플을 섭씨 65도에서 1시간 동안 배양한 다음 100°C에서 10분 간 배양하고 간단한 원심분리를 합니다. 다음으로, 양적 PCR 스트립 튜브의 바이알에 마스터 믹스 18 마이크로리터를 추가하고 적어도 3개의 바이알에 각 DNA 샘플의 2개의 마이크로리터를 추가합니다.
모든 샘플이 로드되면 튜브와 원심분리기를 닫아 각 바이알 의 하단에 있는 용액을 퇴적시하십시오. 바이알을 정량적 PCR용 실시간 열 순환기위에 로드하여 사이버를 불소 염색물로 선택하고 시료 유형으로 알려지지 않았습니다. 그런 다음 각 샘플에서 바이러스 DNA의 상대적 양을 분석하기 위해 정량 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
여기서, 백색 플라이 PSGs, midguts 및 난소에서 염색하는 DAPI에서 TYLCV의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 관찰된 바와 같이, TVLCV는 난소보다 PSG 및 midguts 내의 더 큰 축적을 보여줍니다. 24, 48 및 72 시간 동안 TYLCV 감염 토마토에 공급 한 후 백색 플라이 PSG, midguts, 혈청및 난소에서 바이러스의 정량화는 취득 액세스 기간의 증가와 직접적인 상관 관계에 있는 다른 백색 파리 조직에서 바이러스의 양이 증가한다는 것을 나타냅니다.
죽은 곤충이 해부의 어려움을 증가시킬 것이기 때문에 신선한 흰파리를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 절차에 따라, 서양 블로팅 및 공동 면역 침전과 같은 다른 분석은 바이러스 성 단백질 발현 및 바이러스 성 및 벡터 단백질 상호 작용에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
