このプロトコルは、細胞内のボルバキアの存在を検証するのに役立ち、これはボルバキアとその宿主との間の相互作用を理解する基礎である。このプロトコールでは、細胞内ボルバキア感染を首尾よく検出するために4つの方法が使用され、これは細胞のボルバキア感染の検出精度を裏付け、改善した。手順を実演するのは、現代病原体生物学と特性の主要研究室の大学院生であるQiuqiu Xiaoです。
まず、染色されていないAa23およびAa23-T細胞を、光学顕微鏡を用いて倍率100倍で観察することから始めます。フラスコあたり70〜80%のコンフルエントに達するまで細胞を5〜7日間培養する。ピペットを用いて、1 mLの培養液を微量遠心チューブに移す。
100 RCFで5分間遠心分離し、細胞を回収した。上清を除去し、得られた細胞ペレットを摂氏マイナス20度で保存する。フラスコあたり90〜100%のコンフルエントに達するまで細胞を5〜7日間培養する。
ペレットを0.40mLのPBSに再懸濁し、この溶液50マイクロリットルを微量遠心管に移す。5マイクロリットルの20mg/mLプロテイナーゼKを加え、摂氏55度で1時間インキュベートする。その後、チューブを摂氏99度で15分間インキュベートして粗DNAを取得し、摂氏マイナス20度で保存します。
PCRを行うには、20マイクロリットルの総反応混合物を調製し、テキスト原稿に記載されているようにPCR条件を設定する。ゲルイメージャーを使用して、1%アガロースゲル上のDNAを検出します。リアルタイムPCRシステムでTB Greenを用いて定量PCR増幅を行い、各反応の結果を記録します。
総反応量20マイクロリットルのDNAを分析し、テキスト原稿に記載されているように定量的PCR条件を設定する。確立された標準曲線に従って細胞中のWSPおよびRPS6遺伝子コピー数を計算する。次に、wsp/RPS6のコピー数でボルバキア相対密度を計算します。
独立サンプルの t 検定を使用してデータを分析します。細胞ペレットに200マイクロリットルの溶解バッファーを加え、氷上で30分間インキュベートする。溶解液を12, 000 RCFで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を吸引する。
製造業者の指示に従って、BCAタンパク質アッセイキットを用いて上清のwsp濃度を分析する。15%SDS-PAGEゲルに等量のタンパク質をロードします。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、室温で2時間、5%の脱脂粉乳で膜をブロックする。
その後、TBSTで膜を3回洗浄する。一次抗体を5%スキムミルクで希釈することによって調製した100マイクロリットルの抗wspポリクローナル抗体と共に、摂氏4度で一晩膜をインキュベートする。一次抗体をTBSTで3回洗浄する。
100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を膜に加え、シェーカー上で室温で1時間インキュベートする。TBSTで膜を3回洗浄し、20マイクロリットルの溶液Aと20マイクロリットルの溶液Bを化学発光検出キットに1対1の比率で混合する。膜全体を発光溶液に同時に浸漬し、多機能イメージングシステムを使用して信号を観察する。
レーザー共焦点ペトリ皿で、Aa23およびAa23-T細胞を5%の大気二酸化炭素下で摂氏28度で3〜4日間インキュベートします。細胞が60〜70%のコンフルエントに達したら、PBSで細胞を3回洗浄する。細胞を1mLの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で20分間固定する。
PBSTを使用して固定細胞を5分間洗浄し、PBSで細胞を2回再洗浄する。3%のウシ血清アルブミン1mL中のペトリ皿を摂氏37度で1時間インキュベートする。100マイクロリットルのマウス抗wspポリクローナル抗体とマウス血清をスライドに加え、摂氏4度の湿った箱の中で一晩インキュベートする。
濡れた箱からシャーレを取り出し、室温に戻します。PBSで3回洗い流し、PBSを取り除きます。次の手順を光から守ります。
ペトリ皿を100マイクロリットルのAlexa Fluor 488結合ヤギ抗マウス抗体とともに摂氏37度で30分間インキュベートします。サンプルペトリ皿をPBSで希釈した50マイクロリットルのDAPIを摂氏37度で10マイクログラム/ mLに5分間インキュベートし、PBSで3回洗浄する。免疫染色を共焦点顕微鏡で観察する。
ボルバキアを検出する前に、Aa23およびAa23-T細胞を光学顕微鏡下で観察し、2つの細胞株間の形態学的差異を決定した。Aa23およびAA23-T細胞は少なくとも2つの細胞形態を有していたが、2つの細胞型の間に明らかな形態学的差異は観察されなかった。診断用プライマー81F/691Rを用いて、Wolbachia wsp遺伝子の陽性増幅はAa23細胞で検出されたが、Aa23-T細胞では検出されなかった。
細胞株におけるボルバキア密度の分析は、Aa23細胞では2.4のwsp/rps6比を示したが、Aa23-T細胞ではウォルバキアは示さなかった。タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、Aa23について強いwspシグナルを示したが、Aa23-Tについてはシグナルは検出されなかった。間接免疫蛍光アッセイでは、Aa23細胞でwspタンパク質が検出されましたが、Aa23-T細胞ではDAPI染色DNAのみが検出されました。
培養フラスコを摂氏28度で5%の大気二酸化炭素下で5〜7日間インキュベートすることを確認します。この手順は、サンプル調製と切片化に特に注意を払う必要がある電子顕微鏡観察によって続くことができます。本研究で用いた4つの実験方法により、他の種類の細胞や組織にも適用可能な細胞におけるボルバキア感染の検出精度が確認された。
