このシステムは、組織力の発達、リモデリングおよび成熟に対するこれらの刺激の影響を研究するために、後負荷の様々なレジメンに設計された心臓組織を暴露するために使用することができる。我々の技術は、細胞培養板を開く必要もなく、培養の長期間にわたってカスタマイズ可能なアフターロードルーチンの広い範囲に正確に鼓動組織を置くことを可能にする。私たちの方法は、骨格筋、平滑筋または切除された乳頭筋などの他の筋肉組織培養システムの後負荷を制御するように変更することができます。
私たちのシステムアプローチはかなりユニークであり、多くの科学者が精通していない技術的側面を備えているため、視覚的なデモンストレーションは私たちのセットアップを再現する際に役立つかもしれません。磁気応答性のシリコーンラックを製造するために、テキストプロトコルに記載されているシリコーンポストの24ウェルプレート缶ラックを入手します。固定の極性を使用して、磁石を水で潤滑し、シリコンラックの最も外側の支柱に一度に1つずつ挿入します。
ステンレススチール製の歯科用ワイヤーを使用して、慎重に中空のポストキャビティの底に押し込みます。各ポストに最大5個の磁石を積み重ねることができます。丸い鼻のペンチを使用して、幅11.25ミリメートル、長さ15ミリメートルのブレースにステンレススチール製の歯科用ワイヤーを曲げなさい。
正しい寸法を確実に達成するために、自作の治具を使用してワイヤーの曲げを助け、ワイヤーカッターを使用してブレースとファイルを切断して切断面を滑らかにすることができます。ブレースまたは支柱を水で潤滑し、2番目と3番目をプロセスの最も外側のポストに固定してシリコーンラックに挿入します。テキストプロトコルに記載されているように後負荷調整装置の準備を開始し、非磁性材料を用いて圧電ステージに磁石ホルダーに取り付け、これはL字型のアルミニウムを用いて達成することができる。
組織の視覚的な分析を可能にするには、後負荷調整装置内に光源を取り付けます。ここでは、LEDの配列は、下から心臓組織にエンジニアを照らすのに採用されました。アフターロードチューニングシステムを校正するには、磁気応答性のシリコーンポストが水平に向くように、非磁性材料を使用してシリコンラックの1つを垂直に取り付けます。
今度は、磁気応答性ポストと軸方向に整列するように水平走行直線段階にプレート磁石の1つを取り付けます。水平ステージを使用して、磁気応答性シリコーンポストからの定義された距離をキャリブレーションマグネットに配置します。テスト負荷の影響下でポストの偏向を光学的に記録できるように、このセットアップの側面にカメラを配置します。
アタッチされた荷重が自由にハングアップするのに十分なスペースがポストの下に十分あることを確認します。ポストニュートラルポジションの基準として使用する重みがない場合は、投稿の写真を撮ります。カメラの視点を変えずに、シリコーンポストの一番端に荷重の1つを取り付け、重量の影響を受けてポストベンドの写真を撮ります。
今度は、y 軸上の各試験重量の重力に対する x 軸上のシリコーン ポストの偏向をグラフ化します。これは、力と偏向の間の線形関係をもたらすはずです。00 と取得データを渡す線形回帰関数をプロットします。
この関数の傾きは、テストされた磁石間隔での磁気応答性シリコーンポストの剛性kである。dmax と dmin の間の複数の間隔で、これらの手順を繰り返します。ここでは、約31ミリメートルから約5ミリメートルまでの8つの異なる磁石位置での偏向を分析した。
これらの値を通して多くの回帰関数。たとえば、解析ソフトウェアでは、非線形適合、1つの位相減衰関数を使用します。この回帰関数は、マグネット間隔と後荷重の関係を記述します。
実験用の後負荷調整装置を準備するには、圧電ステージモーターをモーションコントローラに接続し、モーションコントローラをコンピュータに接続します。モーションコントローラが電源にも接続されていることを確認します。次に、モーションコントローラプラットフォームソフトウェアを起動し、モーションコントロールソフトウェアのインストール中にステージボードとして指定されたポートを選択して、piezoステージモーターにソフトウェアを接続し、開いているポートボタンをクリックします。
システムパネルに移動し、ループドロップダウンメニューで開いたループを選択します。手動で磁石プレートを最も高い位置、最も近い磁石間隔のdminに移動します。マグネットプレートは、培養プレートマウントと接触する必要があります。
ここで、ゼロボタンのようにモーションパネルに移動して、ピエゾステージの現在位置をゼロミリメートルにリセットします。手動で磁石ブレードを可能な限り低い位置に移動し、エンコーダ位置を書き留めて圧電ステージモータの動きの範囲を決定します。システムパネルの移動制限を、前のステップで決定した運動の範囲内の値に設定します。
これにより、マグネットブレードが培養ブレードや後負荷調整装置の底面にぶつかるのを防ぎます。もう一度、磁石の刃を最高位置に移動し、ゼロボタンをクリックします。システム・パネルに移動し、フィードバック・ループ・モードをクローズド・ループに変更すると、ステージの位置決めのエラーが確実に修正されます。
これらの設定をシステムに保存するには、ストア パラメータ ボックスの保存ボタンをクリックします。次に、操作された心臓組織を含む24のウェル培養プレートを、培養プレートマウント上に磁気応答性のシリコーンラックに置きます。所望の後荷重を達成するために必要な磁石間隔を計算するために、dについて以前に決定した非線形回帰関数を解く。
計算された磁石の間隔からdminを差し引きます。結果は、磁石プレートが望ましい後荷重を達成するためにゼロ位置から移動する距離です。この値をモーションパネルのターゲット位置 1 入力フィールドに入力し、「Go」をクリックして、設計された心臓組織の後荷重を計算値に調整します。
ラット心臓から産生されたMREHTを制御し、収縮力の高原に達するまで磁気後負荷がない状態で培養した。この日、MREHTと制御されたEHTは同様の平均力を持っていました。翌週、MREHTに対して行われた後負荷は、ポイント9 1から6ポイント8 5ミリニュートン/ミリメートルに徐々に増加し、Ehtを制御するための後負荷は一定のままでした。
平均収縮力は、9つのミリニュートンをポイントまで後負荷の増加に伴って増加し、制御されたEhTのために測定された平均値と比較して3倍以上の力の増加を示した。一方、制御組織に比べてポスト偏向が減少した。培養の最終日に、MREHTのために測定された主な偏向は、コントロールEHTのポイント4 8ミリメートルに比べて、1ミリメートルのポイントに過ぎませんでした。
磁気応答性シリコーンポスト上のRad Ehtsは、高原および収縮力に達するまで、1ミリメートルあたり1ミリニュートンのポイント9の最小後負荷で培養した。この日以降、MREHTは7日間の後荷重レジメンを受け、1ミリメートルあたりポイント9 1と6ポイント8の間で交互に後負荷のサイクルにEHTを公開しました。コントロールEHTの後負荷は、培養期間全体にわたって1ミリメートル当たり60ミリニュートンの時点で一定に保たれた。
観察された差は統計的に有意ではなかった。光学収縮性分析と組み合わせることで、後負荷の変動する大きさに対する短期収縮応答のリアルタイム測定が可能であり、生理学的筋肉特性の調査に有用である可能性がある。強い磁石が突然互いにしがみつき、ユーザーに損傷を与え、磁石自体を損傷させる可能性があり、これを避けるために、磁石を安全な距離で分離しておいてください。
