私たちのプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫に対する物質および関心のある汚染物質の神経行動効果を研究し、これらの薬剤の潜在的な神経毒性を明らかにするための明確なプロセスを提供する。この技術は、ゼブラフィッシュモデルにおける神経行動のハイスループットテストを使用して行うことができる。この方法は、ゼブラフィッシュゲノムがヒトとの相同性が高いため、汚染物質のアアレレ神経行動効果を評価して、化学物質管理や汚染物質による公衆衛生上の問題を示すことができるため、ヒトに対する潜在的な神経毒性を実証するために適用することができます。
ゼブラフィッシュは高スループットスクリーニングの利点を有するため、この方法は向精神薬の開発と環境毒性学研究の両方に関する洞察を提供する。最初の実験を勉強することに脅かされてはいけません。プロトコルに従えば、成功するでしょう。
実験を行う少なくとも2時間前に、室温を摂氏28度に設定し、48ウェルマイクロプレートの各ウェルに800マイクロリットルの露光溶液を追加します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、移動およびパス角度実験に備えて、200マイクロリットルの露光溶液中の1つの幼虫をマイクロプレートの各ウェルに移管する。社会行動実験用に6ウェルマイクロプレートを調製するには、6つのウェルマイクロプレートの各ウェルに4ミリリットルの露光溶液を加え、200マイクロリットルの露光溶液で2匹の幼虫を各ウェルに移す。
テストを開始する前に、高スループットの監視ソフトウェアプログラムを開き、トラッキング回転パスアングルモジュールを選択します。48ウェルマイクロプレートを記録プラットフォームに移し、カバーを引き下げる。[ファイルとプロトコルの生成] をクリックして新しいプロトコルの生成を開始し、[ロケーション カウント] の位置に 48 と入力します。
[パラメーター]、[プロトコル パラメーター]、および [時間] をクリックし、[実験期間] を 1 時間 10 分に設定し、[統合期間] を 60 秒に設定します。楕円形のシェイプツールを使用して、左上ウェルの周りに円を描きます。円を選択し、[コピー]、[右上のマーク]、[貼り付け]、および [選択] をクリックします。
マウスを使用して、コピーした円を右上ウェルにドラッグし、[コピー]、[右上のマーク]、[貼り付け]、および [選択] をもう一度クリックします。次に、コピーした円を右下ウェルにドラッグし、[マークの作成とクリア]をクリックします。システムは、プレートの他のすべてのウェルの上に自動的に円を描画します。
次に、[スケールの描画] をクリックし、画面にキャリブレーションラインを描画します。線の長さを入力し、単位を設定して、[グループに適用]をクリックします。動物の色を黒に設定し、検出閾値を16~18に設定して動物の検出を可能にし、非アクティブに小さい速度を0.5センチメートル/秒、小速から大きな速度を毎秒2.5センチメートルに設定します。
パス角度クラスをマイナス 180 からプラス 180 に設定します(ライト条件を設定するには、[パラメータ]、[ライト駆動]、[下の 3 つのトリガ方法のいずれかを使用する]、および[強化](Enhanced)刺激を使用してライト条件を設定します。[エッジ] をクリックし、暗い期間を 10 分に設定し、その後に 3 サイクルの 10 分の明暗期間を交互に設定します。
次に、プロトコルを保存します。すべてのパラメータが設定されたら、テストルームの照明を下げ、幼虫がシステム内で10分間順応できるようにします。順応期間の終わりに、[実験と実行] をクリックし、実験ファイルを保存するフォルダを作成します。
次に、結果名を入力し、[背景と開始]をクリックします。実験の最後に、[実験と停止] をクリックします。その後、48ウェルマイクロプレートを光インキュベーターに戻し、その後の実験を行います。
すべてのグループは16匹の動物を含むことができるので、システムは単一の48ウェルマイクロプレートの異なる処置条件の下で移動およびパス角度の高い効率テストを行うために使用することができる。幼虫の社会活動は、6ウェルプレートを使用してテストすることができます。この代表的な実験では、BDE-47の最高濃度群は暗黒期に顕著な低活動を示したが、光期間中にBDE-47曝露による変化は認められなかった。
また、6-ヒドロキシ-BDE-47の高濃度群は、受精後5日間でより少ないルーチンおよび平均ターンを行った。しかし、より応答性の高いターンは、6-メトキシBDE47露光群で誘導された。ゼブラフィッシュの社会活動は塩素化パラフィン-70と短鎖塩素化パラフィン-52bによって刺激され、長鎖塩素化パラフィン-52aは幼虫の接触期間を短縮した。
テストのために移された幼虫が正常な水泳能力と奇形がないことを確認することが重要です。色の好み、明暗の好み、すべての暗闇、ゼブラフィッシュの尾の動きなどの他の変数は、環境汚染物質の神経行動毒性に関する追加の質問に答えるために含めることができます。BDE-47暴露溶液は神経毒性であり、内分泌破壊の可能性を有するので、皮膚との直接接触を避けるようにしてください。
