神経炎症は、さまざまな神経障害の重要なプレーヤーです。したがって、病理学的発達の研究を容易にするために、代替のin vivo神経炎症モデルを研究開発することは非常に興味深いことです。ここで説明する技術は、in vivoイメージングを介して脳の病理学的変化をよりよく理解し、可能な抗神経炎症薬を迅速かつ効率的に評価するための優れたツールです。
ガラスキャピラリーチューブを引っ張るための5段階のプロトコルに従って、マイクロピペットプラーを使用してガラスキャピラリーを引っ張ることにより、注入の準備をします。鉗子を使用して、針の先端を適切なサイズに斜めに開きます。針に0.1ミリリットルの鉱油を入れて、泡がないことを確認します。
マイクロインジェクション装置のスチール針のスクリューキャップを取り外します。ガラス針の穴をスチール針に合わせ、ネジキャップを締めます。装填した針マイクロ注入装置をマイクロマニピュレーターに取り付ける。
マイクロマニピュレータが顕微鏡下で装置を柔軟に移動できるように、マイクロ注入装置の位置を調整します。スチールニードルをキャピラリーガラス管に入れるのに必要なパラフィンオイルを適量排出します。70%エタノールで滅菌したスライドガラス上にPBSまたはリポ多糖からなる注射液を滴下し、先端が液滴に挿入されるようにマイクロインジェクション装置を調整する。
約2マイクロリットルの注射液を針に入れます。マイクロマニピュレーターは、マイクロ注入装置の針先が高倍率で幼虫と同じ視野になるように設置します。電子レンジを使用して二重蒸留水に2%アガロースの溶液を溶かします。
溶融アガロースをプラスチック皿に注ぎます。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を2%アガロースコーティングされたプラスチック皿の中央に輸送します。針がアクセスできるように、マウントされた幼虫を脳側を上にして向きを変えます。
ゼブラフィッシュの脳室構造が視野にはっきりと表示されるように顕微鏡の倍率を調整します。針を脳蓋の上に注意深く置きます。70%エタノールで脳の領域をきれいにし、マイクロマニピュレーターを使用して針先でゼブラフィッシュの脳の皮膚をゆっくりと穿刺します。
フットペダルを押して、1ナノリットルの1X PBSまたは異なる濃度のリポ多糖を排出します。注射直後に幼虫をきれいなE3培地に移します。24時間後、顕微鏡イメージング、機関車の行動アッセイ、および他の指標の決定のために幼虫を収集します。
E3培地で1.5%低溶融アガロース溶液を調製し、マイクロ波で加熱して透明な液体を形成します。清潔なプラスチック製のトランスファーピペットを使用して幼虫をスライドガラスに輸送し、できるだけ多くの水を取り除きます。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、1.5%低融点アガロースを幼虫に加えます。
1ミリリットルの注射針を使用して幼虫の向きを変えます。アガロースが冷えて固まるまで待ってから、イメージングを開始します。リポ多糖脳室注射の24時間後に、遺伝子発現マーカーの決定に進む。
2つの1ミリリットルシリンジを使用して、目と卵黄嚢領域のない幼虫の頭部を分離します。組織粉砕機を用いてヘッド部を200マイクロリットルのRNA抽出試薬で毎分11, 000回転で5秒間均質化し、次いでクロロホルムイソプロパノール法を用いてRNA抽出を行う。RNAペレットを5〜10分間風乾した後、30マイクロリットルのRNAseフリー水を加えてRNAペレットを溶解します。
テキスト原稿に記載されているように、ランダムプライマーを含む逆転写酵素を使用してcDNAを合成します。次に、市販のRT-qPCRキットを用いてqPCR系上でリアルタイムPCRを行い、標的遺伝子の発現を測定した。リポ多糖類脳室注射の24時間後に、ゼブラフィッシュ幼虫を96ウェル正方形マイクロプレートのウェルに個々に移す。
各ウェルに300マイクロリットルのE3培地を加え、幼虫を4時間インキュベートして試験プレートに順応させます。幼虫を装填したマイクロプレートをゼブラフィッシュ追跡ボックスに移します。光源をオンにし、テストボックスで幼虫を30分間インキュベートして、環境に順応させます。
自動ビデオ追跡システムを使用してゼブラフィッシュの行動を監視および記録します。個々のゼブラフィッシュの幼虫についてそれぞれ5分間の12セッションを記録し、テキスト原稿に記載されているように合計距離を定義します。24時間の治療後、リポ多糖類脳室注射1ミリリットルあたり1〜5ミリグラムは、対照群および偽群と比較して、TgEtvmat2:GFP幼虫ゼブラフィッシュの脳内のRAニューロンの有意な喪失を誘発した。
トランスジェニック系統elavl3:mCherryゼブラフィッシュは、1ミリリットルのリポ多糖あたり2.5〜5ミリグラムを注射した場合、幼虫の脳ニューロンの蛍光集積密度に有意な変化を示しましたが、1ミリリットルあたり1ミリグラムのリポ多糖を注射すると効果が見られませんでした。さらに、1ミリリットルあたり5ミリグラムのリポ多糖は移動障害を誘発し、60分間の追跡期間にわたってゼブラフィッシュの移動の総距離を減少させました。ゼブラフィッシュ幼虫の頭部における炎症誘発性サイトカインの亜酸化窒素産生およびmRNA発現は、対照群および偽群の発現と比較して、1ミリリットルあたり2.5〜5ミリグラムのリポ多糖処理で増加した。
1ミリリットルあたり1ミリグラムのリポ多糖の注射は、幼虫のゼブラフィッシュ脳への好中球の動員を示し、Tgmpo:eGFPゼブラフィッシュ脳領域の好中球数の有意な増加をもたらしました。ゼブラフィッシュの目や体からの頭部の分離とともに、針の開口部のサイズとマイクロインジェクションのための注入力の量は、この手順にとって非常に重要です。
