我々は行動アッセイの最適化の支援のためにショーンPelkowskiに感謝します。この作品は、母子保健と人間開発研究所、R01 HD060647と国立環境健康科学研究所、F32 ES021342とR03 ES017755によってサポートされていました。

1。ゼブラフィッシュ胚の収集と幼虫を育てる<ol><li> &quot;偽の&quot;草（緑糸から作られた）（ 図1）を有するガラスパイレックス皿を夜明けにタンク内に挿入され、ゼブラフィッシュ胚を収集するために、2時間にしておく必要があります。胚を含むガラス皿は、ハンドヘルドストレーナ上に注ぎ、脱イオン水で洗浄されるべきである。胚はその後、卵の水で栽培されるべきである。卵水は脱イオン水やカビ防止剤として使用されているメチレンブルー、0.25 mg / Lででインスタントオーシャンの60 mg / Lで含まれています。 </li><li>個々の実験の仮説に応じて、胚を直ちに又は毒物または医薬品を使用して、開発の特定の段階で処理することができる。毒物および医薬品は、通常、DMSOに溶解させた（1,000 Xの濃度で）、さらに、卵、水媒体中で直接希釈されるべきである。 </li><li>医薬品や毒物による胚および幼虫の治療中行動解析7におけるDPF（卵水溶液が真菌/細菌の増殖を回避するために、一日おきに、少なくとも変更する必要があるまで、sが、幼虫及び胚を50 1ml当たり約50〜60幼虫の密度で深いペトリ皿内に収容することができる死者胚から）。 </li></ol> 2。行動分析のための金型を準備する<ol><li>特にX 7.6センチメートル×5㎜社内でカスタム構築された11.7センチメートルを測定プラスチック金型を開発しました。金型はサーモサイエンティフィックから単一のウェルプラスチックプレートに注ぎ、アガロースを用いて車線を作成するために必要とされる。シングルウェルプレート対策12.4センチメートルX 8.1センチメートル×1.2センチメートル。 </li><li>金型の側面を60°の角度を付けている5つのレーンが含まれています。金型内のレーンは底幅が14ミリメートルであるのに対し、最も広い上部に18ミリメートルのベースの高3.5ミリメートルです。金型内のレーン（ 図2）の間に4ミリメートルのギャップがあります。 </li><li>レーンを準備するには脱イオン内の溶融アガロース（0.8％アガロースを50mlを注ぐシングルウェルプレートに60 mg / Lでインスタントオーシャン）とDの水。金型は、任意の気泡形成を排除する液体アガロースの上に非常にゆっくり配置し、アガロース（約45分かかります）まで冷却したときに除去することができる。 </li><li>行動実験が実行される前に、アガロースレーンは1日よりも以前に行われてはならない（アガロースが出て乾燥を避けるため）レーンは、最大およそ36時間のために料理に蓋室温で保存することができます。アガロースレーンは、1つの実験のために使用されるべきであり、その後廃棄されるべきである。 </li></ol> 3。画像キャプチャ<ol><li>最大20幼虫には、プレートの各レーンに配置することができます。典型的には、レーンごとに5幼虫を泳ぐ速度の最も正確な追跡を容易にするために、実験ごとに必要とされる幼虫の数を減らすために使用される。レーンは卵水でや実験に応じて、医薬品や毒物なしで充填することができる。しかし、レーンはFであってはならない彼らはイメージングキャビネット内に配置されるまで、すべての方法をilled、これはオーバーフローを防ぐことができます。それらはアガロース金型に入れ、ノートパソコンの画面の上部に配置された後の一貫性を保つために、幼虫は、10分の馴化期間を有するべきである。効率的にペトリ皿からアガロースレーンに幼虫を移動すると、幼虫のストレスを軽減するのに役立ちます。幼虫が浅いタンクやペトリ皿に収納されているとき、これは最も簡単です。 </li><li>イメージングキャビネットは、時間経過の写真撮影やノートパソコンに使わキヤノン製デジタルカメラが含まれています。カメラは、キャビネットの上部に配置され、15.6インチスクリーンのラップトップは、画面（ 図3）上に向けて配置する必要がありますキャビネットの下部に向かって目的とすべきである。 4枚のプレートを直接ノートパソコンの画面の上部に手で位置決めされるべきである。それが（Lの縁に影を排除するためにレーンの上部とレベルであるように、この時点でレーンは卵の水や化学処理をオフに突破することができます画像でanes）。 </li><li> PowerPointプレゼンテーションは、幼虫のために嫌悪刺激として使用されます。過去動く赤のボールで6または12マルチウェルプレート15,17,18で幼虫ゼブラフィッシュが示された。現在PowerPointはプレートの上半分（ 図4）に移動する赤いバーの15分続いて15分間のために空白の背景から始まります。過熱幼虫を排除するためには、28の上方行かない画面温度がノートパソコンを購入するために最善℃ですアガロースレーン内の液体の蒸発を避けるために、最大の撮像時間を1時間未満に保たれるべきである。 </li><li>デジタルカメラは、実験ごとに300枚の合計ごとに6秒撮影、タイムラプス撮影にプログラムする必要があります。しかし、周波数および長さは、実験および行動の定量化に応じて調整することができる。過去の拡張イメージングの時代に各画像間の長い間隔を使用して使用した。カマー動画速度（毎秒30フレーム）で画像化のためのより低い解像度に設定することができる。低い解像度では、単一のマルチウェルプレートに録音を制限している間、ビデオ録画は、イメージング急速な水泳イベント15に適しています。 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>画像はImageJので開くと特に社内で書かれたマクロで使用されるべきである。マクロが自動的に赤い色を除去することができるカラーチャンネルを分割し、バックグラウンドを減算し、しきい値を適用し、粒子分析により幼虫を識別する。 5レーン幼虫分析の最新マクロはZebrafish_macro25kです。画像の数、減算する色、イメージのしきい値などを設定するために、マクロのプロンプトを使用し</li><li>すべての画像は、ImageJのマクロを介して実行された後に、結果ファイルが表示され、Xが含まれ、yは画像番号とレーン番号と一緒に画像ごとに個別の幼虫の座標。 </李&gt; <li>結果ファイルは、Excel形式で保存した後、空白の背景対移動バーの背景とよく数に基づいてソートされるべきである。 Excelテンプレートが自動的にウェルに幼虫の配置を決定する方程式に組み込まれ、幼虫の間の距離、移動速度、および残りの量を有する使用されるべきである。最新のExcelテンプレートは、リクエストに応じて入手可能ですCretonラボで作成25ibです。さまざまな治療群を示すグラフは、治療群とコントロールとの比較のためにt検定と一緒にExcelシートに組み込まれなければならない。さらなる統計的分析はSPSSを用いて行うことができる。 </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は継続的に我々の小説の行動アッセイを改善しているが、それは常にゼブラフィッシュ幼生15で回避と接触走性行動の検出に有用であった。多くの試験はそのような使用刺激の色として、アッセイの結果を最適化するために行われてきた、レーンあたりの幼虫、行動アッセイの長さの理想的な数。以前、我々は、マルチウェルプレート（6または12ウェルを有する）15,17,18を使用していました。しかし、最近我々は我々は、単一のアッセイ16（ 図5）における行動の措置の多くを収集できるようにする幼虫のための大きい水泳スペースを作成するための新しいレーン型を作成しました。その他の変更は、PowerPoint示す（アッセイの改変動きや長さ）と（我々はまた、より狭い車線のための金型を持っている）を使用レー​​ンの大きさのバリエーションが含まれています。 現在、このハイスループット自動化されたシステムは、zebrにおける行動の大規模な範囲を測定する独自の機能です。例えば、速度、回避、他の幼虫に近接し、マルチレーンプレート中の接触走性と同時にafish幼虫。結果を迅速に得ることができ、幼虫多数の撮影時に分析することができる。システムは、セットアップが構築する、安価で迅速かつ簡単なの両方です。このシステムの制約は、3次元運動がゼブラフィッシュ幼虫で評価することができないことである。大人のゼブラフィッシュを追跡する自動化システムは,3-D能力を有し、水柱10,19内で上下に移動などの動作の広い範囲を識別することができる。別の制限は、我々の撮像システムは、現在のビデオ速度でのハイスループット分析のために最適化されていないことである。低い解像度15にカメラを設定するときに、ビデオ速度撮像が可能であるが、これは単一のプレートに分析を制限する。 新しく作成された &quot;レーン&quot;メソッドを使用して、アッセイのいくつかの部分は、正確な方法で実行する必要があった。 Tにおける幼虫を配置するとき彼レーン、それはプレートがノートパソコンの画面の上に配置されるまで、液体のレベルが非常に浅いあることを確認することが重要です。レーンが液体のいっぱいである場合、幼虫は、プレートの外周にエスケープします。また、アガロースに金型を挿入する際に、注意が非常にゆっくりと金を下げるように注意する必要があります。金型が早すぎる挿入されている場合、気泡がアガロース中に形成され、追加の幼虫のようにイメージJマクロによって識別される。これは、アガロースレーンも少ない泡を持っている場合、それは新しいものを作るのがベストであることをお勧めします。 今後は、このようなゼブラフィッシュ幼生での学習など、他の複雑な挙動を分析し、学習を早期開発における毒性物質や医薬品への曝露によって影響を受ける可能性がある方法を調べるために私たちの行動のアッセイを最適化したいと思います。我々は現在の行動の結果は脳領域であるかを決定する容易のできる学習行動を分析するのに有用であり得るアッセイに取り組んでいます開発中に特定毒物または医薬品の影響を受ける。自動化されたアッセイは、ゼブラフィッシュの幼虫20と、これらのアッセイでの学習挙動を測定するために開発されているマルチレーンプレートで堅牢な回避反応を用いてハイスループットスクリーニングのために修正可能であってもよい。 我々は、この行動アッセイは、医薬品や毒物が多数発生への影響を試験するための今後の研究に用いることができることを提案する。このような研究は、特定のリスク要因に豊富な情報を提供し、妊娠中の女性と子供のためのよりよい健康と安全のガイドラインを設定に寄与する。

ゼブラフィッシュは、遺伝、発達や行動科学1-4のための普及したモデルになってきています。彼らは、2〜3日後に受精（DPF）で彼らのchorionsから孵化4-5 DPFで完全に機能する臓器を開発し、7 DPF 5,6によって行動を多数展示。ゼブラフィッシュの幼虫は、理想的にはサイズが小さいため7,8のハイスループット解析に適しています。ソフトウェアは、幼虫と成虫ゼブラフィッシュ9-14における行動の自動分析のために市販されている。しかしながら、このソフトウェアは高価であり、マルチウェルプレート中のゼブラフィッシュの幼虫の複雑な挙動を測定するための限られた選択肢を有することができる。 我々はセットアップが安価であり、7 DPFのゼブラフィッシュの幼虫15,16で異なる行動の数を定量化できる新規なハイスループットイメージングシステムを作成しました。システムは、数に胚の暴露後、私たちは迅速かつ効率的に微妙な行動異常をテストすることができます医薬品や環境毒物16-18。 システムは、キャビネットの上部にある家は、デジタルカメラの木製キャビネットを使用して構築されました。カメラは、ラップトップは15を上向きに画面が置かれるキャビネットの下部に下向き。タイムラプス撮影が車線内の幼虫の配置をキャプチャするために使用される。幼虫はノートパソコンの画面の上部に配置された4つのマルチウェルまたはマルチレーンプレートに中に収容することができる。私たちは、幼虫が遠ざかって（回避）とエッジ（接触走性）15,17に向かって泳いで応答するに嫌悪刺激としてPowerPointプレゼンテーションを使用しています。画像は、自動化されたマクロは、カラーチャンネルを分割バックグラウンドを引き算し、個々の幼虫を識別するためのしきい値を適用するために使用されるImageJのにインポートされる。座標は、各画像の各幼虫のために記載されています、我々は回避とthigmotaを定量化するために使用してExcelファイルに挿入することができます軸ロボットP行動、魚の距離に魚、泳ぐ速度、残り16の量。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

私たちは、マルチレーンプレートに7日齢ゼブラフィッシュの幼虫の行動を分析するための新規ハイスループットイメージングシステムを作成しました。このシステムは、PowerPointプレゼンテーションを経由して幼虫に表示される自発的な行動や嫌悪刺激に対する応答を測定します。記録された画像を自動的にカラーチャンネルを分割ImageJのマクロで分析され、バックグラウンドを減算し、車線内の個々の幼虫の配置を特定するためにしきい値を適用する。我々はその後、泳ぐ速度、車線の端または側面のための好み、休息行動、接触走性、幼虫の間の距離、および回避行動を定量化するためのExcelシートに座標をインポートすることができます。行動の微妙な変化を簡単に環境毒物や医薬品への曝露後の行動分析のための、それが有用なもの、我々のシステムを使用して検出される。

我々の以前のアッセイにおいて、野生型の幼虫はよく（回避行動）でダウンして泳いで、よく（接触走性行動）15の端に向かって移動するボールに対応する、跳ねるボール嫌悪刺激を未処理のされている使用して。後ほど、このアッセイにおいて接触走性行動がゼブラフィッシュ幼生17で不安関連行動の尺度であることを確認した。空白の背景と比較した場合、幼虫の動きに大きな違いは、ボールとエッジのための好みからありました。これらの動作は、また移動赤いバーを使用して、私たちの新しいアッセイで確認され、さらに堅牢な16アールた。さらに、我々は今、泳ぐ速度、残り、井戸の終わりまたは側面を優先し、魚との距離（ 図5）を含む、単一のアッセイにおいて、行動の多くを試すことができます。卵の水で育った制御の幼虫が増加好みが皿に、レーンの端にダウンして見せる上げ装置は、それらが嫌悪刺激（赤いバーを移動）が掲載されています。幼虫1μgの/ mlのDMSO、一般に1,000 Xのストック溶液として種々の医薬品および毒性物質を溶解するために使用される溶媒を含む卵の水に成長させる場合にも同様の結果が得られる。 代表的な結果は、卵、水とDMSO（コントロールなど）と、一般的に非有機食品で見つかった有機リン系殺虫剤の様々な濃度で処理した幼虫で、図5に示されている。示された結果は一つの実験からのサンプリングです。しかし、繰り返されるとき、結果は泳ぐ速度と接触走性行動は、人間の食糧消費18のレベルを模倣する有機リン系殺虫剤の低濃度、によって変更されることを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> 図1。コレクショントレイ。ガラスパイレックス皿は、電子を収集するために使用されている成魚の水槽からmbryos。パイレックス皿から蓋を切断し、プラスチックグリッドと緑の糸がプラスチックでグリッド上に縫い付けていたと挿入した。これは、自然環境を模倣で大人ゼブラフィッシュの繁殖雰囲気を演出しています。 <img alt="図2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> 図2。プラスチック金型とアガロースレーン。 A）金型は、左に表示されています。 0.8％アガロースを1ウェルプレートに注ぎ、金型はゆっくり挿入し、アガロースが冷却されたときに削除されますB）右側のプレートは、プラスチック成形によりアガロースで作成されたレーンを示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> 図3。イメージングキャビネット。イメージングキャビネットのspeciallあったyは我々の研究室で構築し、高スループットの行動分析に使用。 15メガピクセルデジタルカメラ、ノートパソコンの画面上に配置マルチ·プレートで幼虫のタイムラプス画像を収集するために下向きにキャビネットの頂部に取り付けた。プレートとスクリーンとの間に収集された画像におけるモアレを防止するために使用されるプラスチック製のディフューザがある。 <img alt="図4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> 図4。空白の背景およびPowerPoint嫌悪刺激。これはゼブラフィッシュ幼生における行動の変化を喚起するために使用され、現在のパワーポイントです。それは）空白の背景およびB）移動赤いバーの間に堅牢な動作の違いを提供しています。 <img alt="図5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> 図5。ハイスループットアッセイで定量行動。我々はX、幼虫のy座標に使用するExcelシート内の私達の行動のアッセイから定量化される行動の例。白いバーは空白の背景にさらされると赤のバーはPowerPointで赤移動バーにさらさ幼虫からのデータを表示幼虫からのデータを表示。グラフは）B、レーンの端にある幼虫の割合、C）レーンの端に幼虫の割合、D）との間に距離を車線内に幼虫の）パーセンテージダウン行動の分析から得られる測定値を示す魚（mm）の、E）は、幼虫の幼虫の速度（mm /分）、F）パーセンテージ残りを泳ぐ。図示のグラフでは、データはtreatmであるDMSOコントロールおよび0.001〜0.1μM（一般的に人間の食事で見つかったレベル）に至るまで、いくつかの農薬濃度の幼虫のENTは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

automated-high-throughput-behavioral-analyses-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K ビュー.  Brown University. 我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。

ビデオ: Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

神経科学

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIMイメージングとFIMtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

エコHIV脳感染症のラットモデル

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

インビボ ゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

著者スポットライト:三次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生のin vivo全脳イメージング  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...