全ゲノムシーケンシング、ゲノムマイニング、分子ネットワーキングは、ここで説明するゲノムマイニングプロトコルの質量分析ガイドの基礎を構成しています。そして、自然製品発見における最も現代的なアプローチです。クラスター内のゲノムマイニングと分子ネットワーキングの一致は、全ゲノムシーケンシングのコード化された注釈と、活性分子によるへそを発見するための大きな見通しを提供する粗抽出物からの化学再構成シグネチャを伴う。
原則として、ゲノムマイニングは、実験ごとに単一または少数の分子群を対象とします。これにより、検出速度が遅くなります。この意味で、ゲノムマイニングと分子ネットワークの活用は、天然物研究の重要な進歩です。
質量分析ガイドゲノムマイニングは、粗抽出物からの大量のデータに含まれる複数の化学型の情報を同時に構造化できる汎用性の高い方法です。今日では、細菌、真菌または植物の配列提供を探索することができる高範囲の方法論です。化学型から遺伝子型、化学型バイオインフォマティクスへの化学型は、生合成クラスター間のリンクであり、小分子製品です。
プロトコルを聞くことは、ストレプトマイセス種の代謝抽出物で観察されるペプチド産物にへそ周期深さを特徴付けるために実証される。しかし、それは真菌や植物のシーケンスと抽出物にも適用可能です。ゲノムデータセットをうまくキュレーションすることは非常に重要であり、今日では断片化したドラフトシーケンスは、ほぼ完成した配列データに取って代わられています。
また、新しい生理活性天然物にアクセスし、MS-Guideアプローチと組み合わせるために、さまざまな戦略が開発されています。天然物の分離・構造解明の改善につなげつつ、製品の分離を図ります。ここで遺伝子型を化学型アプローチに接続しているように、生合成クラスター間のバイオインフォマティクスリンクと低分子製品が重要です。
化合物の多様性と種類を推定し、ゲノムによってコード化する。これはレプリケーションを意味します。後で、GNPSを使用してイオン類似度に基づくクラスタリングを事前に形成することができます。
この手順を実証するのは、この研究の共同研究者であるレナータ・シグリスト博士とアンゴリーニ教授です。完全な配列ゲノムから二次代謝遺伝子クラスターのアノテーションに関するインシリコ情報を取得する。アンチスマッシュプラットフォームに、遺伝子バンクE-M-B-Lまたはより高速なフォーマットの配列ファイルを提出します。
したがって、最も類似した既知のクラスターに基づいて、出力データから関心のある遺伝子クラスターのように。BGCのDNA配列情報に基づいて、エコリストレプトマイセスの遺伝子クラスターに隣接する20〜25ヌクレオチドの間で原色を設計する。人工染色体ライブラリースクリーニング。
原稿による組換え異種生物を得た後、適切な発酵培地で株の100分の1を予め培養する。液体ISP2メディアなど。培養器の上に30°C、220 RPMで7日間培養します。
接種後、培養物を2200倍Gで10分間遠心分離する。セルを廃棄し、セパレーター漏斗に上澄み出しを転送します。酢酸エチルを1巻に1本加え、シェイクします。
有機層と黙認層が分離するまで1~3分待ちます。そして、エルレンマイヤーフラスコに有機層を収集します。MS/MS データを取得します。
制御ソフトウェアを用いて適切なHPLCおよび質量分析法をプログラムする。MS/MSネットワークは、与えられた質量分光条件下で検出可能な分子ネットワークである点に留意する。プロテアウィザードからMS変換を使用して、質量スペクトルをmzXML形式に変換します。
変換の入力パラメータを調整します。変換された LC-MS/MS ファイルを GNPS データベースにアップロードします。2 つのオプションを使用できます。
ファイル転送プロトコルを使用するか、オンライン プラットフォームを介してブラウザで直接使用します。GNPSでアカウントを作成したら、作成したアカウントにログインし、分子ネットワークを作成するを選択します。役職を追加します。
基本的なオプションを実行します。分子ネットワークを実行する mzXML ファイルを選択します。最大 6 つのグループで編成します。
したがって、レプリケーション解除ルーチンのライブラリと同様です。0.02ダルトンと0.05ダルトンの質量公差に対する前駆体イオン質量許容範囲とフラグメントDaをそれぞれ選択します。ネットワークの詳細オプションを実行するには、ネットワーク クラスタのサイズと形式に直接影響するパラメータを選択します。
高度なパラメータは GNPS ドキュメントにあります。作業が完了したときにアラートを受信する電子メール アドレスを選択し、ジョブを送信します。GNPS の結果を分析する。
GNPS にログインします。ジョブを開くために実行されたジョブ、公開済みジョブを選択します。ウェブページが開き、分子ネットワーキングから得られたすべての結果が表示されます。
すべてのネットワーク クラスターを表示するには、ブラウザ ネットワーク ビジュアライザーで [スペクトル ファミリを表示] を選択します。生成されたすべての分子ネットワーキングクラスタとともにリストが表示されます。仮の分子識別は、すべてのIDに表示されます。
[表示] を選択して、それらを視覚化します。分子ネットワーククラスタを解析するには、[ネットワークを視覚化]を選択します。ノード ラベル ボックスで、親質量を選択します。
エッジ ラベル ボックスで、共同署名またはデルタ Emz を選択します。ノード間の類似性または質量差をそれぞれ観察する。マルチグループ解析の場合は、ノードの色付けボックスで[円を描く]をクリックします。
各ノードが各グループに出現する頻度を観察する。すべてのライブラリを表示するには、[ビュー]、[すべてのライブラリ、ヒット]を選択します。GNPS プラットフォームで直接断片化スペクトルを開きます。
または、元の生のファイルでは、手動でデレプリケーション化合物と関連化合物の構造解明を確認します。このプロトコルは、ゲノムマイニング、異種発現およびMSガイドコードアプローチの組み合わせを使用してうまく例示された。新しい特殊なバリノマイシンとアナログ分子にアクセスします。
標的バリノマイシンのゲノムから分子へのワークフローをここに紹介します。クロマトグラムは、バリノマイシン、モンタナスタチンおよび5つの類似体がバリノマイシンによって産生されたことを示し、生合成遺伝子クラスターは異種宿主で発現した。バリノマイシンに対応する分子ネットワーキングイオンは、レンサプマイセス種にアノプトされた対応する生合成遺伝子クラスターを有する既に知られている化合物であり、CBM AIは2つのゼロ42ゲノムである。
アナログに関連するイオンを集めてから、まずバリノマイシン生合成遺伝子クラスターについて説明する。バリノマイシンおよび関連アナログのMSスペクトルおよび化学構造をここに示す。全ゲノムシーケンシングを実行し、適切なデータセットキュレーションを行うことは、ゲノムマイニングをMSガイドするための生合成クラスターを選出するための最初のステップです。
全体の手順は、野生の種類の文字列粗抽出物で行うことができますが、あなたの興味の遺伝子クラスターを選択し、異種の発現を促進することを選択することができます。DNAサンプルから生合成遺伝子クラスター全体を捕捉するための異なる方法が記載されている。このプロトコルの最も強い利点は、代謝プロファイルを迅速に複製し、MSデータでゲノム情報を繁殖させる能力です。
新たな分子のようにこれらを解明するために。そして、ドリス・チャイムらの研究グループは、まずペプチドゲノミクスおよびグリコーゲノミクスの分野で説明された。そして、NPS統合メタボロミクスとゲノムマイニングアプローチの導入後、分子ネットワークと生合成能力を結びつける最も汎用性の高い道となっています。
