このプロトコルでは、2つの部分を含む手順を記述します。まず、接触阻害による単層2Dケラチノサイト分化法in vitroである。第2に、RNA-seqによるその分子特性。
2D in vitro の分化方法は、簡単で簡単に実行できます。特に多数の細胞が必要な場合は、表皮分化を研究するために使用できます。例えば、エピゲノム解析において。
詳細なRNA-seq分析パイプラインは、基本的なバイオインフォマティクスのスキルを持つ研究者にとって明確で透明であり、あらゆるバルクRNA-seq分析に使用できます。初めて分化プロトコルを実行する場合は、シード密度が難しい場合があります。複数のシード密度を試して、セルラインに最適なものを見つけてください。
まず、ケラチノサイト増殖培地またはKGMおよび500ミリリットルの増殖培地および分化媒体を原稿の指示に従って調製することから始める。1次ケラチノサイトは、5〜20,000細胞/センチメートル平方メートルの密度で種をまき、細胞を覆うのに十分な増殖培地を加える。播種の2日後、増殖培地で細胞をリフレッシュする。
顕微鏡下で定期的に細胞をチェックし、一日おきに培地をリフレッシュしてください。細胞が90%合流に達すると、培地を分化培地に変えて分化を誘導する。さらなるRNA分析のために細胞を収集するには、DPBSで細胞を2回洗浄し、次に溶菌バッファーを追加します。
分化日0、2、4、および7で細胞を収集します。RNAの単離後、二本鎖cDNAを変換し、次世代シーケンシング用にRNA-seqライブラリを用意します。シーケンスに続いて、シーケンス読み取りがダウンロードされ、ヒトゲノムにマッピングされます。
R パッケージをダウンロードしてインストールした後、readspergene.out からアカウント テーブルを生成します。タブファイルを開き、すべてのファイル名、区別の日、その他の関連するサンプルデータを含むサンプルデータファイルを書き込みます。例については、補足のコーディング・ファイルを参照してください。
次に、カウント テーブルとサンプル データを使用して、カウント可能データとサンプル データの両方を含む deseq2 オブジェクトを生成します。遺伝子発現の正規化の場合は、deseq2RLD または VST 正規化のいずれかを使用して、deseq2 オブジェクトのカウント テーブルを正規化します。RLD の正規化が望ましいですが、VST 正規化は非常に高速です。
R の dist 関数を使用して、正規化された読み取りカウントの強度に基づいてサンプル距離をプロットし、サンプル距離に基づいて hclust クラスタリングを実行します。次に、pheatmap 関数を使用してヒート マップをプロットします。最後に、deseq2のplotPCA関数を使用して、正規化された読み取りカウント強度の原理成分分析またはPCAプロットを生成する。
PCA は探索的データ分析のツールとして機能し、異なるサンプル間の距離と接続を視覚化するために使用できます。異なる時点からサンプル間の分散を並べ替えることによって上位500の高可変遺伝子を抽出するrowVars関数を用いて、高可変遺伝子発現解析を行います。これらの遺伝子は、分化の日全体にわたって正規化された強度の最高の標準偏差を持っています。
高変数遺伝子に対してk-平均クラスタリングを行い、異なる発現パターンでクラスター化します。pheatmap パッケージを使用して、ヒート マップ内のジーンを視覚化します。ヒート マップにプロットされる強度は、中央値を減算した deseq2 正規化強度です。
1つのサンプルに10個を超えるカウントを持つすべての遺伝子を含む発現したバックグラウンド遺伝子のリストを生成し、各クラスターの遺伝子を含むリストを作成します。最後に、GOrillaを用いて遺伝子オントロジー解析を行う。背景遺伝子リストを背景セットとして使用し、クラスター内の非常に可変遺伝子のリストをターゲットセットとして使用し、検索エンリッチドGO用語をクリックします。
あるいは、より高度な R ユーザーは、パッケージ clusterProfiler を使用して GO 用語エンリッチメント分析を自動化することもできます。5個体由来のケラチノサイト線をRNA-seq分析で分化するために用いた。主成分分析は、分化を受けているケラチノサイトが結合していたが、全体的な遺伝子発現プロファイルが異なっていることを示した。
高度に可変遺伝子をクラスター化し、分化中の遺伝子発現ダイナミクスとパターンを可視化した。遺伝子の各クラスターは、ケラチノサイト分化特徴遺伝子と遺伝子オントロジーアノテーションによって表され、遺伝子機能に明確な違いを示した。2番目の実験では、P63変異を持つ患者由来の健常コントロールのケラチノサイトと細胞株の細胞形態と遺伝子発現の違いを比較した。
主成分分析は、対照細胞株が分化パターンに明らかに従うことを示したが、分化中の変異細胞の遺伝子発現パターンは増殖または未分化細胞のそれとほとんど類似したままである。クラスタリング解析では、クラスター1の遺伝子はコントロール細胞でダウンレギュレートされ、R204WおよびR279H突然変異を担う患者細胞では部分的にダウンレギュレートされたが、R304Wを担う細胞では高いままであった。これらの遺伝子は、遺伝子オントロジー分析で示されるように細胞増殖に役割を果たす可能性が高い。
クラスター2遺伝子が最初に導入され、その後コントロール細胞でダウンレギュレートされた。これらの遺伝子は、表皮分化および角化機能がこのクラスターに対して高度に富んでいたため、ケラチノサイト分化に関与する可能性が高い。クラスター3の遺伝子は、表皮の最外層で役割を果たす可能性があることを示す対照細胞の分化の終わりにのみ誘導された。
RNA-seqデータを分析する際には、何を期待すべきかを事前に知ることが重要です。これは、品質管理とPCAプロットの解釈と、結果が意味をなしているかどうかを評価する際に役立ちます。我々の方法は、表皮生物学および他の生物学的システムの両方で遺伝子転写を研究するために使用することができる。
