이 프로토콜에서는 두 부분을 포함하는 절차를 설명합니다. 먼저, 접촉 억제에 의한 시험관 내 단층 2D 각질 세포 분화 방법. 둘째, RNA-seq에 의한 분자 특성.
2D 시험관 내 분화 방법은 간단하고 수행하기 쉽습니다. 특히 많은 수의 세포가 필요한 경우 표피 분화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 전도 분석에서.
상세한 RNA-seq 분석 파이프라인은 기본적인 생물정보학 기술을 가진 연구자에게 명확하고 투명하며, 모든 벌크 RNA-seq 분석에 사용할 수 있습니다. 처음으로 분화 프로토콜을 수행할 때 시드 밀도가 까다로울 수 있습니다. 셀라인에 가장 적합한 시드 밀도를 알아보십시오.
원고 방향에 따라 각질 세포 성장 매체 또는 KGM 및 500 밀리리터 각각의 증식 배지 및 분화 매체를 준비하는 것으로 시작합니다. 5~20, 000세포의 밀도로 1차 각질세포를 제곱하고 세포를 덮을 수 있는 충분한 증식 배지를 추가한다. 파종 후 2일 후, 증식 배지로 세포를 새로 고칩니다.
현미경으로 세포를 정기적으로 확인하고 격일로 매체를 새로 고칩니다. 세포가 90%에 도달하면 배지를 분화 배지로 변경하여 분화를 유도한다. 추가 RNA 분석을 위해 세포를 수집하려면 DPBS로 세포를 두 번 세척한 다음 용해 버퍼를 추가합니다.
분화일 0, 2, 4, 7일에 세포를 수집합니다. RNA 격리 후 이중 좌초 된 cDNA가 변환되고 RNA-seq 라이브러리는 차세대 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 시퀀싱 후, 시퀀스 판독은 인간 게놈에 다운로드되고 매핑됩니다.
R 패키지를 다운로드하고 설치한 후 readspergene.out에서 계정 테이블을 생성합니다. 파일을 탭하고 모든 파일 이름, 차별화 일 및 기타 관련 샘플 데이터가 포함된 샘플 데이터 파일을 작성합니다. 예를 들어 추가 코딩 파일을 참조하십시오.
그런 다음 카운트 테이블과 샘플 데이터를 사용하여 카운트 가능한 데이터와 샘플 데이터를 모두 포함하는 deseq2 개체를 생성합니다. 유전자 발현 정규화를 위해 deseq2RLD 또는 VST 정규화를 사용하여 deseq2 개체의 카운트 테이블을 정규화합니다. RLD 정규화를 선호하지만 VST 정규화는 훨씬 빠릅니다.
R에서 dist 함수를 사용하여 정규화된 읽기 수 강도에 따라 샘플 거리를 플롯한 다음 샘플 거리에 따라 hclust 클러스터링을 수행합니다. 다음으로, pheatmap 함수를 사용하여 열지도를 플롯합니다. 마지막으로, deseq2의 플롯PCA 기능을 사용하여 정규화된 판독 수 강도의 원리 성분 분석 또는 PCA 플롯을 생성한다.
PCA는 탐색 데이터 분석의 도구로 사용되며 서로 다른 샘플 간의 거리와 연결을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 상이한 시점의 샘플 간의 분산을 주문하여 상위 500개의 고가변 유전자를 추출하는 rowVars 기능을 사용하여 매우 가변적인 유전자 발현 분석을 수행합니다. 이 유전자는 분화의 일 동안 그들의 정규화된 강렬의 최고 표준 편차를 가지고 있습니다.
다른 발현 패턴에 의해 클러스터링하기 위해 고가의 유전자에 k-means 클러스터링을 수행합니다. pheatmap 패키지로 열지도에서 유전자를 시각화합니다. 히트 맵에 플롯된 강도는 중앙값과 함께 deseq2 정규화된 강도입니다.
단일 샘플에서 10 개 이상의 카운트를 가진 모든 유전자를 포함하는 표현된 배경 유전자의 목록을 생성하고 각 클러스터에서 유전자를 가진 목록을 만듭니다. 마지막으로, GOrilla를 사용하여 유전자 종양학 분석을 수행합니다. 배경 유전자 목록을 배경 세트로 사용하고 클러스터의 매우 가변적인 유전자 목록을 대상으로 설정한 다음 검색 강화GO 용어를 클릭합니다.
또는 고급 R 사용자는 패키지 클러스터Profiler를 사용하여 GO 용어 보강 분석을 자동화할 수 있습니다. 5명의 개인에게서 유래된 각질 세포 라인은 RNA-seq 분석에서 분화를 위해 사용되었다. 주요 성분 분석은 분화를 겪고 있는 각질 세포가 연결되었지만 뚜렷한 전반적인 유전자 발현 프로파일을 보였다는 것을 보여주었습니다.
매우 가변적인 유전자는 분화 도중 유전자 발현 역학 및 패턴을 시각화하기 위하여 군집되었습니다. 유전자의 각 클러스터는 각질 세포 분화 특징 유전자및 유전자 온톨로지 음표에 의해 표현되었다 유전자 기능에 있는 명확한 다름을 보여주었습니다. 두 번째 실험에서, 세포 형태학 및 유전자 발현 차이는 P63 돌연변이를 운반하는 환자에게서 파생된 건강한 대조군 및 세포주로부터 각질 세포사이를 비교하였다.
주요 성분 분석은 대조군 세포주 명확하게 분화 패턴을 따르는 것으로 나타났지만, 분화 중 돌연변이 세포의 유전자 발현 패턴은 증식 또는 미분화 세포의 것과 크게 유사하다. 클러스터링 분석에서, 클러스터 하나에 있는 유전자는 통제 세포에서 다운규제되고 R204W 및 R279H 돌연변이를 운반하는 환자 세포에서 부분적으로 다운규제되었습니다, 그러나 R304W를 운반하는 세포에서 높게 남아 있었습니다. 이 유전자는 유전자 종양학 분석에 의해 표시된 대로 세포 증식에 있는 역할을 확률이 높습니다.
클러스터 2개의 유전자는 통제 세포에서 처음 소개되고 그 후에 다운규제되었습니다. 이 유전자는 표피 분화 및 각질화 기능이 이 클러스터를 위해 높게 농축되었기 때문에 각질 세포 분화에 관여할 가능성이 높습니다. 클러스터 3의 유전자는 대조구의 분화 의 끝에서만 유도되어 표피의 가장 바깥쪽 층에 있는 역할을 할 수 있음을 나타냅니다.
RNA-seq 데이터를 분석할 때, 무엇을 기대해야 하는지 미리 아는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 품질 관리와 PCA 플롯을 해석하고 결과가 적합한지 평가하는 데 도움이 됩니다. 우리의 방법은 표피 생물학뿐만 아니라 다른 생물학적 시스템에서 유전자 전사를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
