オリゴデンドログリア系系細胞の精製および培養の効率的な方法について述べています。これにより、オリゴデンドロサイト分化を制御する分子メカニズムと、髄鞘化プロセス中のニューロンとの相互作用に対処することができます。この振れ技術は高価ではなく、大量のオリゴデンドロサイトを得るのに最適です。
このような培養は、オリゴデンドロサイト調節培地およびニューロンを有するオリゴデンドロサイトの共同培養の生産を可能にする。多発性硬化症は、中枢神経系における焦点脱髄によって引き起こされる疾患であり、オリゴデンドロサイト喪失に対する二次的である。オリゴデンドロサイト文化は、再髄鞘化を促進する方法をよりよく理解するためのツールを提供します。
オリデンドログリア細胞培養のみで、オリゴデンドロサイトの開発と生物学を調節する固有のメカニズムに関する洞察を提供できる。ニューロンとの共培養は、神経生理学への影響に関する洞察を得ることを可能にする。まず、湾曲した鉗子を使用して、動物の頭部を目の高さに維持します。
小さな外科用ハサミを使用して頭蓋骨の基部に小さな切開を行い、脳の正中線に続く頭蓋骨を切断します。鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの部分を中線からそっと剥がします。頭腔から脳を取り除くために小さな外科スプーンを使用してください。
氷冷PBSグルコースを含む60ミリメートルのペトリ皿に脳を氷の上に入れます。ステレオ顕微鏡で見て、小脳、脳幹、および大脳半球から嗅球を除去するために微細な鉗子を使用する。2つの大脳半球を分離するために細かい鉗子を使用してください。
細かい鉗子を使用して髄を剥がします。大脳皮質を氷の上に60ミリメートルのペトリ皿に入れます。層流フードで、鋭いメスを使用して大脳皮質を細かく刻みます。
酵素消化培地を含む50ミリリットルのチューブに細かく刻んだ組織を移す。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで30分間インキュベートする。その後、ピペットを使用して酵素消化培地を穏やかに除去し、皮質組織がチューブの底に残っていることを確認します。
P1000マイクロピペットを使用して、DMEM 10%の胎児の子牛血清を1ミリリットル加え、組織を穏やかに三分性します。70ミクロンのフィルターと1ミリリットルシリンジのピストンを使用して、皮質組織を50ミリリットルチューブにフィルターします。DMEM 10%胎児の子牛の血清で50ミリリットル管の内管壁の残留組織を数回リンスする。
50ミリリットルチューブにDMEM 10%の胎児の子牛の血清を充填します。室温で5分間423回gで遠心分離機。上清を慎重に取り除き、DMEM 10%の胎児の子牛の血清の2ミリリットルで細胞のペレットを再懸濁させる。
P1000マイクロピペットで細胞ペレットを穏やかにトリチュレートし、次いでP200マイクロピペットでトリチュレートします。DMEM 10%の胎児の子牛の血清の適切な容積で細胞懸濁液を薄くする。T-150フラスコの5ミリリットルの細胞懸濁液を10倍の密度で10倍から5番目の細胞/平方センチメートルでプレートします。
各T-150フラスコに20ミリリットルの温かいDMEM 10%胎児の子牛血清を加えます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベート。サンプルを250rpmと摂氏37度で一晩振盪した後、主にオリゴデンドロサイト系統細胞を含むフラスコに上清を収穫するが、いくつかのミクログリア細胞も、非コーティングされた100ミリメートルのペトリ皿に盛り付ける。
摂氏37度と炭酸ガス5%の加湿インキュベーターでペトリ料理を15分間インキュベートします。これにより、皿表面上の差動速接着を通してミクログリア細胞を除去することができます。その間、各T-150フラスコに25ミリリットルの温かみ、作りたての培養培地を充填し、2回目の揺れまで5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベートします。
次に、ペトリ皿から新しい非コーティングされた100ミリメートルのペトリ皿に上清を移し、残留ミクログリア細胞の接着を可能にする。5%の二酸化炭素の下で37摂氏で加湿インキュベーターでペトリ料理を15分間インキュベートします。非接着オリゴデンドロビ細胞を含む2つのペトリ皿から上清を取り除き、50ミリリットルのチューブに移します。
ミクログリアをメッキしたペトリ皿を捨てます。423回gで5分間チューブを遠心分離する。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを1ミリリットルのボツテンシュタイン・サト培地で再懸濁します。
すべてのペレットを一般的な 50 ミリリットルチューブにプールし、ボツテンシュタイン-サト培地で細胞密度に応じて 20 または 30 ミリリットルのボリュームを調整します。プレート2または3は、細胞懸濁液の10ミリリットルと100ミリメートルペトリ皿をコーティングしました。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベート。
2時間後、ボッテンシュタイン・サト中ミディアムのすべてをリフレッシュして、ペトリ料理から破片を取り除きます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで培地に2日間インキュベートする。2日後、顕微鏡で培養を調べる。
層流フード内で、滅菌条件下で、培地の中程度の暖かいMPB-27の10ミリリットルで培養培地を更新する。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで2日間インキュベートする。OCMを収穫するために、オリゴデンドロサイト分泌因子を含む上清を集める。
フィルターは0.22ミクロンフィルターを使用してOCMを殺菌する。本プロトコルでは、オリゴデンドロサイト系統細胞を、星状細胞およびミクログリアを振り払ってグリア培養物から精製した。異なるマーカーの発現の分析は、オリゴデンドロサイト培養物が主にO4陽性細胞の90プラスマイナス4%、85プラスマイナス7%NG2陽性細胞、4.7プラスマイナス2.1%のPLP陽性細胞を有するオリゴデンドロサイト前であり、7.2プラスまたはマイナス2.5%の細胞がGFAP陽性細胞であった。
このような培養から産生されたOCMは、精製された海馬ニューロン培養物に3日間インビトロで添加した。この治療法は、異性タンパク質のクラスタリングを促進します。海馬ニューロンの髄鞘化は、14日間のインビトロでオリゴデンドロクチを添加して研究した。
20日から24日目のインビトロで、ミエリン塩基性タンパク質などのミエリンマーカーの免疫染色により、ランヴィエのミエリンセグメントおよびノードの可視化が可能となった。コアPBSは、髄液除去のために重要です.活発なクリアリングは、オリゴデンドロクチエの生存可能性とピペットで適用される流れの強さを実現するために重要です。
オリゴデンドロサイト調節培地をニューロン培養物に加えて、オリゴデンドロキセ分泌因子が神経生理学に及ぼす影響についての洞察を得ることができる。ニューロンとのオリゴデンドロクチオンの共培養も、髄鞘形成過程を研究するために行うことができる。
