著者らは、このプロトコルの改良と年間のサポートのためのNIH（DA19808とOMにDA15014）に貢献した以前の研究室のメンバーに感謝。アンナアプト1&quot;neuroAIDSの学際的およびトランスレーショナルリサーチ研修&quot;（T32 - MH078795）の仲間であり、したがって、この作業はルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞5T32MH079785下の国立衛生研究所によって部分的にサポートされていました。

1。グリアの解剖（〜2週間メッキニューロン前） <ol><li> 70％エタノールで清の代わりに滅菌ツールの準備を行うには、60 mmの培養ディッシュ（脳あたり一皿）に4 mLの冷解剖媒体を追加し、解凍するため氷の2.5％トリプシンとDNaseを置く（表VIにおける手術器具の詳細を表示する）。 </li><li> 100ミリメートル滅菌シャーレ2〜4日齢の子犬と場所の頭を刎ねるために、大きなハサミを使用してください。 </li><li>皮膚を通して正中線のカットを作成し、頭蓋骨を露出する肌を引き戻すために培地はさみを使用してください。脳組織の下に損傷を与えることなく、頭蓋骨を通して正中線カットと2つの側面カットをするために湾曲したハサミを使用してください。脳を露出する上部の頭蓋骨を取り外します。 </li><li>脳を抽出し、（組成は表Iを参照）4 mLの冷解剖の培地を含む独自の60mmディッシュに入れてください。実体顕微鏡（ライカZOOM 2000、ズーム制御：7-30）の下に皿を置き、半球を分離するために5番の鉗子を使用し、中脳を削除し、そして皮OFF髄膜。 </li><li>冷たい解剖培地で新鮮な60mmディッシュ内のすべての解剖脳皮質を収集し、湾曲したハサミを持つ組織をミンチ。 </li><li>滅菌済み15 mLの試験管にみじん切りの組織を移す。冷たい解剖培地で4.5 mLまでのボリュームを持参し、2.5％トリプシンの500μLを加える。 パラフィルムで真空管をラップし、反転によって5分ごとに混合、15分間37℃の水浴中に浮く。 （注意：ここで我々は最大5頭まで使用しているとき我々は一般的に従うプロトコルを記述し、より多くの子犬が使用されている場合、ボリュームが適切に調整する必要があります） </li><li>引き継がトリプシン含有解剖媒体の体積を最小限に、新しい15 mLの試験管に組織を移す。新鮮な解剖培地で4.8mLにボリュームを持参し、60 ug / mlと（ストック溶液：解剖の培地2ml中のDNaseおよび5 mgの硫酸マグネシウム3mgの）の最終濃度になるように200μLのDNaseを加える。滅菌5mLのピペットで静かに〜20回ひいて粉にするTEは、その後（組成については、表IIを参照）グリアメッキ培地10mLを加える。 </li><li>組織の大部分は4-5分のために解決することを許可し、50mLのチューブに細胞懸濁液の上位80％を譲渡。グリアのメッキ媒体（および必要に応じてより小さいピペットを用いて）の、さらに2〜3 mLの組織の粉砕を繰り返して、再び、組織が和解し、以前のコレクションに上位80％を追加することができます。 280グラム（またはIECセントラCL2遠心1300 rpm）で15分間グリアメッキ媒体と遠心で20mLの全量をもたらす。 </li><li>上清を吸引除去し、（ほぼ使用される子犬の数に応じて5〜7 mLを用いて）グリアメッキ培地で細胞ペレットを再懸濁します。その後解剖し、各脳に対して10mLを持つために追加のメッキ媒体を追加してください。各75センチメートル2フラスコ（フラスコあたりつまり1つの脳）にも、プレートの細胞懸濁液10mlを混ぜる。 </li><li> 37℃インキュベーターにセットして培養フラスコを移動℃のCO2（5〜10％、ナトリウムbicarbonaに比例する培地のTEの内容）。 3〜4日ごとにし、24〜48時間後に培地を変更します。 </li></ol> 2。二次グリア（メッキのニューロンの48時間前） <ol><li>各洗浄とオートクレーブthermanoxの周囲に溶融paraplastワックスの3小滴を加えることによってthermanoxカバースリップを（神経細胞が皿上に播種する場合）を用意。細胞はthermanoxのこの側面に播種されます。私たちのthermanoxは再利用可能な手作りです〜プラスチックからカット60 mmの挿入（試薬の表VIを参照）を介して掘削〜50 2 mmの穴を、市販の文化も挿入が代わりに使用することもできる。 </li><li>精力的にどんなアタッチされていない細胞を除去するために、各フラスコを振って、PBSで2回と主なグリアを洗ってください。コンフルエント主要グリアと各フラスコには約1000万アストログリアを提供する、従って私達は定期的に実験2〜4フラスコを使用してください。 </li><li> 0.05パーセントtryspin - EDTA（PBS中、第9 mLに希釈した1 mL10X 0.5パーセントトリプシン- EDTAストック溶液）で細胞を剥離する。コンビNEは、1つの50 mLコニカルチューブに2フラスコから細胞と（試薬の表IIを参照）グリア細胞のメッキ液の同量を追加します。 280 gで15分間遠心する上清を吸引除去し、グリア細胞のメッキ媒体の数mLでグリア細胞ペレットを溶解する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし（〜1 × 10 6細胞/ mL）、必要に応じて細胞懸濁液を希釈し、プレートは（60皿（神経細胞がカバーグラス上に播種される場合）で、またはthermanoxのカバースリップ上のいずれかの細胞を神経細胞は、上にメッキされる場合60ミリメートル皿）。細胞は、グリア細胞のメッキ液を使用して、皿やthermanoxあたり500,000個の細胞で播種してください。その後2時間グリアメッキ媒体におけるフリップthermanoxと水没のセルの後thermanoxカバーグラス、滴下方法で細胞のプレート600μL、の場合に。 </li><li>神経カバースリップのための二次グリアの60 mmディッシュを準備する場合、神経解剖の前に夕方のN2.1に培地を変更してください。 </li></ol> 3。神経解剖と文化<ol><li>物理的に細胞層を分離し、細胞の掻き取りを防止するために、各滅菌カバーグラスの周囲に溶融paraplastワックスの3小滴を追加することにより、カバーガラス（直径15mm）を準備します。細胞はカバースリップのこの側面上にメッキされます。 </li><li> 2時間または一晩、0.5 mg / mLのポリリジンでコーティングプレートやカバースリップ（表VIを参照してくださいどちらポリ- L -リジンまたはポリ- D -リジンは、ホウ酸緩衝液に溶解した）。滅菌水で2〜3回洗い、完全に乾かします。注：カバーグラスをカバースリップを組織培養皿に配置されている場合、簡単に発生する可能性ポリ-リジンまたはセルメッキ、とコーティングの間にこぼれる/ソリューションの広がりを避けるために、疎水性のペトリ皿に配置されています。 </li><li>グリア郭清（ステップ1.1）の場合と神経解剖の準備。 17日間の妊娠ラットを安楽死させる、70％エタノールで毛皮をスプレーし、子宮を露出する皮膚を通して内側にカット。すべての胎児を取り出して、中に置いてください滅菌100 mmディッシュ。 </li><li>急速に自由細かく分析し、それぞれの胎児の首を切る、冷たい解剖の培地（4mL）で独自の60mmディッシュに各ヘッドを配置すること。約2,000万のニューロンがそれぞれE17胎児に由来すると我々は、通常、実験4〜5胎児を解剖。より多くの胚が必要な場合は、全体の手順は（ステップ3.4から3.12から）以上の90〜100分を持続していないことを確認してください。 </li><li>実体顕微鏡とNo.1/No.5鉗子を使用すると、皮膚や頭蓋骨を開いて引っ張って脳を抽出し、半球を分離し、中脳と髄膜を除去することによって大脳皮質を分離。 </li><li>冷たい解剖培地と新鮮な60mmディッシュにすべて切除した皮質を収集し、そして約1 mmの部分に曲線ハサミで組織をミンチ。 </li><li>滅菌済み15 mLの試験管にみじん切りの組織を移す。冷たい解剖培地で4.5 mLまでのボリュームを持参し、2.5％トリプシンの500μLを加える。 パラフィルムで真空管をラップし、15 minu用36 ° Cの水浴中に浮く反転によって5分ごとに混合TES、。 </li><li>引き継がトリプシン含有解剖媒体の体積を最小限に、新しい15 mLの試験管に組織を移す。新鮮な解剖培地で4.8 mLに持参し、60 ug / mlとの最終濃度になるように200μLのDNaseを加える。滅菌5または2 mLのピペットで約10回をひいて粉にする、組織の大部分を分離するファイアーポリッシュ（コールド）パスツールピペットを使用して、必要に応じてこの手順を繰り返します。 4-5分のために解決するし（もしあれば、一般的には非常に少ない）は、組織の残りの部分ができます。 </li><li>組織の定着部分を残しながら、上部のシングルセルサスペンションを削除し、ニューロンのメッキ液の等量（表IIIを参照）を使用して、新しいチューブにこのソリューションを配置。優しくよく混ぜ合わしかし、その後、細胞を数える;必要に応じて15ミリメートルカバースリップ（200μLで35,000細胞ごと）または60 mmディッシュ（3 mLの1 × 10 6細胞ずつ）上にプレート。インキュベーター（36.5 ° C、5〜10％CO2）にセルを転送する。 </li><li> 3-4時間のCOMBIN後電子ニューロン層と次のように二次グリア。 60 mmの培養ディッシュ上でニューロンの場合は、、暖かいDMEMで細胞を洗浄の無血清培地4mlの（N2、表IVを参照）に培地を変更し、各プレート（グリア細胞は神経細胞が直面している必要があります）にグリアワンthermanoxを追加します。神経細胞をカバーグラスの場合は、ニューロンが下向きで、二次グリアの各60 mmディッシュに3〜5カバースリップを転送する。 </li><li> 24時間ニューロンをめっきした後、グリア細胞の増殖を防ぐために、各皿にシトシン-β- D -アラビノフラノシドの10μMを追加。我々は、4mMのストック溶液を準備し、N2培地で1:10に希釈し、各ディッシュに希釈した溶液の25 UL / mLを加える。 </li><li>正確な時間が必要な分化段階に依存するが、細胞は一般的に、文化の中で7〜10日後に実験に使用され、生存期間が有意に低下することなく4週間にのために育っている。最初の週後に、それはメディアの半分のボリュームが毎週交換することをお勧めします。 </li></ol>ニューロンは基板に取り付けて数時間後、彼らはlamelliopodiaを拡張し始める。プロセスは、細長い（図2A）と文化の中で数日間にわたって分極し続け、そして拡張された軸索と樹状突起は、（図2B、MAP2染色）はっきりと見える。ニューロンは樹状喬木がより精巧になり、それらがシナプスの連絡先を開発する成熟するにつれて、約2-3週間、多くの樹状突起をめっきした後（図2C）11表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig1.jpg" /> 図1。グリアフィーダーレイヤー（二次グリア）と一緒に培養ラット皮質ニューロンのための手順のフローチャート。最初に、11日間神経解剖する前に、主要なグリア細胞の培養は、新生児ラット（P2 - 4）から調製される。細胞（神経解剖前にプライマリグリアと二日をめっき後のおよそ九日）コンフルエントのときに、アストロサイトはメカです。anically皿またはthermanox上にオリゴデンドロサイト前駆細胞とミクログリアとメッキのどちらか（二次グリア）から分離。ニューロンは、E17胚およびカバースリップ上または皿（ポリ-リジンでコーティングされた）のいずれかでメッキの皮質から取得されます。メッキ後4時間、ニューロンの層は二次グリアに追加されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3257/3257fig2.jpg" /> 図2様々な段階での文化の例（例えば、5時間、12 DIV、21 DIV）。。図は、異なる時点でのカバースリップ上で皮質ニューロンの代表的なイメージです。ニューロンは、基板のニューロンに接続した後lamelliopodiaを拡張し始める。位相コントラスト画像は5時間メッキ（）の後にいくつかの拡張神経突起を示しています。真ん中の画像（B、Cookら、2010年から、許可を得ては）固定され、神経細胞樹状突起のマーカーMAP2で免疫染色12 DIV皮質ニューロンを示しています。ヘキスト染色をcounterstaiとして使用された寧。神経細胞が成熟するにつれて樹状突起棘は、また（C）見えるようになります。スケールバー：A、B =25μmと、C =10μmである。

<ol>
	<li>Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+chemokines:+regulation+of+fractalkine/CX3CL1+homeostasis+by+SDF/CXCL12+in+cortical+neurons.">Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons.</a> J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).</li><li>Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12+inhibits+expression+of+the+NMDA+receptor's+NR2B+subunit+through+a+histone+deacetylase-dependent+pathway+contributing+to+neuronal+survival.">CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor's NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival.</a> Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).</li><li>Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+increases+brain+levels+of+ferritin+heavy+chain+leading+to+inhibition+of+CXCR4-mediated+survival+signaling+in+neurons.">Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons.</a> J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).</li><li>Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+regulate+hippocampal+neuronal+signaling+and+gp120+neurotoxicity.">Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+P53+activity+by+CXCR+4.">Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).</li><li>Patel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neuronal+CXCR4+by+the+micro-opioid+agonist+DAMGO.">Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO.</a> J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).</li><li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+transcription+factor+E2F1+in+CXCR4-mediated+neurotoxicity+and+HIV+neuropathology.">Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology.</a> Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+CXCR4+regulates+cell-cycle+proteins+in+neurons.">The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons.</a> J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).</li><li>Khan, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+CXCL12+promotes+survival+of+postmitotic+neurons+by+regulating+Rb+protein.">The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein.</a> Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).</li><li>Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-mediated+regulation+of+ANP32A/Lanp,+a+component+of+the+inhibitor+of+histone+acetyl+transferase+(INHAT)+complex,+in+cortical+neurons.">CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons.</a> J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>D'Ambrosio, J., Fatatis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+modulate+Ca2++signaling+in+bone-metastatic+prostate+and+breast+cancer+cells.">Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ニューロンは、実験的な分析のために容易に分離できるようにすることながら、このプロトコルでは、グリア細胞の存在下で培養ラット初代皮質ニューロンための方法を提供する。健康な神経表現型のグリアの開発をサポートする一方、生理学的に適切な方法で実験的な治療にも変調する神経細胞応答。さらに、この細胞集団の神経細胞で培養する前に、主要なグリアを継代することにより?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>16 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0.22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmolarity</td>
			<td>310&plusmn;10 mOsm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Dissection Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>50 &mu;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabe 2. Glia Plating Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Neuron Plating Medium.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>50 mg/100mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 4. N2 Medium.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Concentration</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borate</td>
			<td>12.5 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Reagent</th>
			<th>
				Company</th>
			<th>
				Catalogue number</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose Dulbecco's Modified Eagle 
			Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>26400-044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, Heat-inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>H1138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750-060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white, Grade VI 
			(Ovalbumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15400-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas 
			(DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-646-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine-&beta;-D-arabinofuranoside hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica ZOOM 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 
			0.13-0.17 mm</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox sheets</td>
			<td>Grace BioLabs</td>
			<td>HS4550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>70-4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped No.5 forceps</td>
			<td>Fine Science 
			Tools</td>
			<td>91150-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern No.1 forceps</td>
			<td>Biomedical 
			Research</td>
			<td>10-1400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, sharp-blunt</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>28-1435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting scissors</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>11-2070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Curved scissors</td>
			<td>Biomedical 
			Research 
			Instruments</td>
			<td>11-1395</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia

このビデオでは、グリアフィーダー層、bilaminarまたは共培養モデルとして知られているシステムの存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのプロセスをガイドします。このシステムは、ガラスまたはプラスチック製の成長基板のどちらかを必要とする実験の様々なニーズに適しており、ニューロンの他のタイプの培養にも使用できます。 後期胚のステージ（E17）から得られたラット皮質ニューロンは、ガラス製カバースリップまたはそれぞれ、皿やプラスチック製のカバースリップ（Thermanoxとして知られている）上に成長させたグリア細胞のフィーダー層が直面している組織培養皿に播種されています。 2つの構成の選択は、特定の実験が必要な場合があります使用されるテクニック、、かどうかに依存し、そのニューロンは、ガラス（例えば、カルシウムイメージングに対するウエスタンブロット）で栽培されています。グリアフィーダー層、混合グリア細胞のアストログリア富化二次培養は、別々に新生仔ラットの皮質（P2 - 4）から神経細胞への事前の用意されています解剖。 神経細胞の培養物と比較して、この培養系の主な利点は、唯一の神経細胞の成長、生存、そしてより正確に生体内で脳の環境に類似したグリアフィーダー層、から分泌される栄養因子が提供する差別化のサポートです。また、共培養は、ニューロングリアの相互作用1を研究するために使用することができます。 同時に、神経細胞層におけるグリア細胞のコンタミネーションは、他の確立された方法に匹敵する実質的に純粋な神経細胞層につながる別の手段（低密度の文化、有糸分裂阻害剤の添加、最適化された培地の血清および使用の欠如）、1によって阻止される-3。神経細胞は、容易に培養中にいつでもグリア層から分離し、電気生理学4、細胞分子生物学5-8、生化学5、画像処理とマイクに至るまでさまざまな実験的なアプリケーションに使用できますroscopy 4,6,7,9,10。いくつかの細胞株は、プロセスを拡張する作業が主なニューロンは、機能的なシナプス11を形成する神経細胞株で観察されていないプロセスを軸索と樹状突起を拡張。 この共培養系を用いて培養ラット海馬ニューロンの詳細なプロトコールは、以前は4,12,13記載されている。ここでは詳細皮質ニューロンに適した修正プロトコルを。約20x10 6個の細胞がそれぞれのラットの胚から回収されるように、この方法では、ニューロン（しかし非常に均一な神経細胞集団が心配ではない）を大量に必要とする実験のために特に有用である。ニューロンとグリア細胞の調製は時間特異的に計画する必要があります。我々は、ニューロンをサポートするために、培養ラット皮質ニューロンと同様に培養グリア細胞のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

ここでは、グリアフィーダー層の存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのためのプロトコルを提供しています。培養神経細胞は極性を確立し、シナプスを作成し、そのような電気生理学、カルシウムイメージング、細胞生存アッセイ、免疫細胞化学、およびRNA / DNA /タンパク質の分離など、さまざまな用途での使用のためのグリア細胞から分離することができる。

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K ビュー.  Drexel University College of Medicine. ここでは、グリアフィーダー層の存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのためのプロトコルを提供しています。培養神経細胞は極性を確立し、シナプスを作成し、そのような電気生理学、カルシウムイメージング、細胞生存アッセイ、免疫細胞化学、およびRNA / DNA /タンパク質の分離など、さまざまな用途での使用のためのグリア細胞から分離すること...

ビデオ: Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

成人ラット尿膀胱からの一次ニューロンとグリアの分離と培養

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...