このプロトコルを使用すると、リアルタイム条件下で細胞移動と侵入を明らかにすることができ、遺伝子機能および薬物の喪失または利益の下で細胞の運動学を決定することができます。他の方法とは異なり、染色、機械的細胞損傷、または蛍光マーカーは必要ありません。最も重要なことは、リアルタイム細胞動態は有効な方法で決定することができる。
U-118MG細胞株培養が70〜80%合流に達したら、細胞を0.5%トリプシン-EDTAの2ミリリットルで処理する前にPBSで細胞を洗浄してください。30秒後摂氏37度、10ミリリットルの新鮮な培養培地で反応を停止し、剥離した細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。カウント後、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを10回から5番目の細胞濃度で適切な量の新鮮な培地で再懸濁する。
条件ごとに5番目の細胞に6回10回を1マイクロ遠心分離チューブに移し、各チューブにDulbeccoのPBSの800マイクロリットルを追加します。遠心分離後、各ペレットを60マイクロリットルの再懸濁バッファーRおよび6マイクロモルの目的のsiRNAで再懸濁する。各細胞懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを3つの10ミリ秒1、350ボルトパルスで電解する前に、各チューブを穏やかなタッピングと混ぜます。
各処理後、各条件から電気泳動細胞を新鮮な培養培地の個々の5ミリリットルのアリコートにプールする。その後、条件ごとに2つの35ミリメートル培養皿に細胞を播種し、細胞培養器に3日間置きます。リアルタイム細胞分析の5~6時間前に、リアルタイムの細胞分析システムを細胞培養インキュベーターに入れる。
侵入アッセイを設定するには、逆ピペット処理を使用して、細胞外マトリックスゲルの1ミリリットル当たり0.1マイクログラムを補ったDMEMの50マイクロリットルを、細胞浸潤板の上部チャンバーの各ウェルに入れます。めっきの直後に、各ウェルから細胞外マトリックス溶液の30マイクロリットルを取り除き、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。インピーダンス測定プログラムをセットアップするには、測定の6時間前に、すべての電気泳動細胞培養液中の培地を低血清培地に交換する。
関連するインピーダンス測定ソフトウェアの[レイアウト]タブで、各生物学的条件に対して4倍のウェルを選択します。[スケジュール]タブで、1 分間間隔で 1 回のベースライン測定スイープ ステップを設定し、2 番目のステップを設定して、実際の実験の個々のクレードルのセルインピーダンスを測定します。細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、細胞浸潤および移動板の下の部屋のウェルに10%の牛血清を補充した培地の160マイクロリットルを化学誘引剤として加える。
浸潤を測定するために、細胞外マトリックスゲル被覆ウェルを含む上部チャンバを組み立てる。移動を測定するには、上部チャンバーでコーティングされていない井戸を使用してください。いずれのタイプの実験でも、上部チャンバーの井戸を低血清培地50マイクロリットルで満たし、チャンバーをシステムのクレードルに入れます。
ソフトウェアの「メッセージ」タブをクリックして、すべてのウェルが制御装置によって認識されているかどうかを確認します。メッセージが期待どおりに表示される場合は、クレードル内のプレートが実験の準備が整います。その後、完全にパックしたプレートをリアルタイムの細胞分析システムのクレードルの細胞培養インキュベーターに1時間置き、プレートを細胞培養条件に順応させます。
プレートが平衡している間に、実証したように神経膠芽腫細胞を収穫し、低血清培地濃度の800マイクロリットル当たり8倍の10倍から5番目の細胞で各条件から細胞を再懸濁する。さらに、下流のウェスタンブロット分析のために35ミリメートル皿に播種するための培養培地の2ミリリットルの5番目の細胞に3回10〜5番目の細胞を取っておきます。ベースラインの移行前の読み取り値を測定するには、順応の最後に、クレードルの [Start] ボタンをクリックします。
ベースライン測定が取得された後、それぞれの揺りかごからバイオセーフティキャビネットに移動および侵入プレートを移します。逆ピペット100マイクロリットルの細胞は、クレードルの制御ユニットにプログラムされた細胞の浸潤および移動プレートの適切な井戸内の各生物学的状態の上のチャンバーウェルを4倍にする。播種後、プレートをバイオセーフティキャビネットに室温で30分間保管し、プレートをそれぞれのクレードルに移す前に、細胞がプレート底に均等に落ち着くようにします。
クレードルの[開始]ボタンをクリックして、セルインピーダンスの測定を開始します。実験の完了中または完了後に時間依存的にセルインデックスとしてのセルインピーダンスの変化を視覚化するには、[データ分析]タブを開きます。それぞれの条件のデータを個別に、または平均または標準偏差として視覚化するには、平均および標準偏差のオプションボックスをクリックします。
セルインデックスデータをスプレッドシートファイルにエクスポートするには、データ分析ウィンドウの中央にカーソルを置き、右クリックします。表示されるダイアログボックスで、[データをリスト形式にコピー]オプションを選択し、開いているスプレッドシートにデータを貼り付けます。実験をリリースするには、各クレードルのリリースボタンをクリックします。
Crkアダプタータンパク質のノックダウンは、Crk様タンパク質レベルを誘導することなく、Crk1およびCrk2タンパク質レベルをそれぞれ85%および86%減少させます。Crk様のノックダウンは、Crk1およびCrk2タンパク質レベルのわずかな低下でCrk様タンパク質発現を85%減少させます。両方のsiRNAを組み合わせることで、Crk1、Crk2、Crk様発現が80%以上減少し、ビンクリンとアルファ-チューブリンの発現はCrkまたはCrk様のノックダウンの組み合わせの影響を受けません。
ヒト脳神経膠芽腫細胞は、高い血清濃度に応答して勾配に沿って移動し、13時間で最大の移動レベルに達する。Crkノックダウン細胞では、最初は移行が遅れているが、細胞は23時間まで移行を続けた。Crk様のノックダウンは、CrkとCrk様の両方のノックダウン時に神経膠芽腫細胞株が完全に移動能力を失い、CrkとCrk様が癌細胞の移動に不可欠な重複する役割を果たしていることを示唆する細胞移動を実質的に減少させる。
しかし、細胞の浸潤が数日間にわたって監視されると、Crkノックダウン細胞は、Crk様細胞が侵襲的能力を部分的に回復し、40時間後に侵襲能力を低下させることを示す二重Crk-Crk細胞を用いて60時間で神経膠芽腫細胞を制御するのと比較して、同様の最大レベルの細胞浸潤に達する。この結果は、細胞の浸潤を実験の全期間にわたって分析すべきであるという提案を明確に裏付けている。細胞の適切な数を播種し、浸潤アッセイおよび播種細胞のための細胞外マトリックスを記録しながら気泡を避けることは、この実験の成功のための重要なポイントです。
同様の手順に従ってeプレートを用いて、細胞接着および細胞増殖動態を決定することができる。
