この作品は、国立衛生研究所（ES07408とEB00208）からの補助金によって支えられている。

1。 ECIS /タクシー電極の調製<ol><li> ECIS /タクシー電極アレイ（スライドあたり8室から成る）の金表面は、最初の無菌条件下で室温で15分間脱イオン水（のdH 2 O）中の滅菌10mMのシステインによる前処理によって安定化されています。 </li><li>各電極室からシステイン溶液を吸引し、無菌のdH 2 Oで3回リンスし、完全培地250μlの（RPMI1640、10％FBS、25mMのHEPES緩衝液）に置き換えます。 </li><li>電極チェックを実行するために楽器の配列ホルダーのピンを接触する電極アレイを接続します。 </li><li>正しく接続されているチャンバーは、コンピュータの画面上に緑色で強調表示されます。チャンバーは赤で強調表示されている場合は、それらが接続されていないと電極がすべてのチャンバーの連絡先を確立するために配列ホルダーに再配置する必要があります。 </li><li>すべてのチャンバが接続されたら、阻止するためのソフトウェアのコントローラで &quot;チェック&quot;ボタンをクリックしてください各チャンバの初期抵抗値と容量値を採掘。抵抗値は1600〜2000オームである必要があり、容量値は、8室配列の5〜6ナノファラッドでなければなりません。室は、これらの許容パラメータの範囲内にない場合は、個々のチャンバーは、データを収集するために使用すべきではありません。 </li><li>個々のアガロース室を準備するために配列ホルダーから電極を外します。チャンバーから培地を吸引除去し、無菌のdH 2 Oで、それぞれの室を3回洗浄</li></ol> 2。アガロースチェンバースの準備<ol><li> Seakem GTGアガロースの滅菌15 mlのポリプロピレンコニカルチューブ、測定0.03グラムで、1 mlの滅菌PBSを追加します。大まかにチューブのキャップを交換し、（電子レンジで融解がこのアッセイのために有効ではありません）2分液体サイクルのオートクレーブ中でアガロースを溶かす。この短い時間では、コニカルチューブを溶かすことはありません。培養のための血清を必要としない以下の気難しい細胞（例えば、 キイロタマホコリカビ ）0.5％アガロースは、適切な培地中で行われ、電子レンジで溶融させることができる。電子レンジで溶かした場合、これは変性されるように、オートクレーブは、血清が必要な細胞が必要です。 </li><li>水浴（55℃-60℃）を直接、熱いアガロースに穏やかに混合するための上下0.5％アガロースとピペットの最終濃度に温め完全RPMI培地5mlを追加します。 </li><li>各チャンバーに溶かしたアガロース培地のピペットで300μlのは、留学生センター/タクシー配列のカバーを交換し、室温でゲル化することができます。 </li><li>アガロースゲルを評価するために、15 mlのチューブのキャップにアガロースを残りのピペット。この過剰なアガロースは、パート4にも使用されます。アガロースに井戸を切断。 </li></ol> 3。カニューレも切削工具を構築し、シャープ<ol><li> 5/64 &quot;ビットを使用して、2つの14ゲージの平滑末端カニューレを強めています。ドリルビットは、各カニューレオペアンプの内部全体エッジをカットし、特定の製造、低速ドリルで各カニューレ開口部にドリルビットの先端を回転させる鋭い切れ刃（ 図4A）を形成するening。 </li><li>ドリルプレスのビット1 &quot;×2&quot;×¼ &quot;5/64プレキシガラス（ 図4B-D）&quot;を介して2つの穴を開けます。それはそれぞれのプレキシガラスの穴から等しい距離を突出するように、各シャープ14ゲージのカニューレを挿入します。 </li></ol> 4。アガロースにウェルズを切断<ol><li>軽くヒントを炎で14ゲージのカニューレを殺菌。前のECISチャンバー内に井戸を切断し、カニューレを室温まで冷却し、15 mlチューブのキャップにアガロースをタッチしてカニューレを冷却することができます。カニューレの温度が高すぎるとチャンバーのウェルが切断されると、アガロースは、不格好な、欠陥の井戸をレンダリングし、溶けてしまいます。 </li><li>各チャンバー内のターゲット電極（ 図2cおよび5）を囲む2つの金のドットの上にカニューレペアの位置を合わせます。カニューレとの間に穏やかな接触時に停止し、任意の水平移動することなく、カニューレを垂直に挿入電極表面。慎重に、任意の水平移動せずに再度、カニューレを削除します。グラデーションに反対するための追加の井戸の配置は、カニューレ治具の再構成でも可能です。 </li><li> 静かにアガロース廃棄物をキャッチし、真空トラップを低真空圧に接続されている無菌9 &quot;パスツールピペットを使用して、カニューレによって残されたアガロースプラグを吸引除去する。 </li><li>アガロースを飽和させるために2分間、37℃で各チャンバーの表面°Cに完全RPMI培地300μlを追加して、静かにアガロースを乱すことなく、表面、ウェルから培地を吸引除去する。 </li></ol> 5。ウェルズのロード<ol><li>各ウェルは7μlのボリュームを保持できます。各チャンバー内の1つのウェルに、細胞懸濁液7μlを追加します。 Jurkat T細胞は、2×10 7細胞/ mlを使用しています。これらの細胞は、血清欠けている不​​完全なRPMIで希釈し、200 ng / mlのSDF-1αの7μlに対応させていただきます。負の続きとして単独で完全なメディアを使用してROL。 </li><li>井戸がロードされた後、全てのウェルが適切にカットし、満たされたことを確認するために倒立顕微鏡で配列の各チャンバーを表示します。細胞はよくの境界の範囲内でなければなりません。彼らは井戸の両方で見られている、またはセルだけでなく国境を越えて広がっている場合は、そのギャップはアガロースの下で形成されています。データは確実にそれらのチャンバーから解釈することはできませんので、不適切な設定の井戸に注意してください。 </li></ol> 6。データ収集<ol><li>配列ホルダーに電極を配置して、ホルダーのバネ付きのポゴ·ピンに電極アレイ上の金パッドを再接続し、 &quot;セットアップ&quot;をクリックしてください。正しく接続されている井戸は、緑色で強調表示されます。井戸が赤になっている場合、それらが接続されていないと電極が配列ホルダーに再配置する必要があります。 </li><li>アレイ構成を示すために、ソフトウェアのパネルのドロップダウンメニューから &quot;8WE1&quot;（8ウェル1電極）を選択します。 </li><li>ソフトウェアCONTRに &quot;チェック&quot;を選択します。各ウェルの初期抵抗値と容量値を決定するオールパネル。静電容量値が5〜6ナノファラッドである必要がありますが抵抗値は、1600〜2000オームでなければなりません。 </li><li>いくつかの周波数での抵抗を測定するために、複数の周波数を選択します。周波数をカスタマイズ、または推奨される周波数のセットを使用しての選択があります。標準的な複数の周波数の取得設定は、8ウェル/分の速度で（52.5、125、250、500、1,000、2,000、4,000、8,000、16,000、32,000と64,000 Hzの）11あらかじめ設定した周波数でデータをキャプチャします。測定間の時間間隔はカスタマイズすることもできます。複数の周波数データを収集すると、静電容量、インピーダンス、抵抗の分析が可能になります。 4000 Hzでの抵抗値を収集すると、哺乳動物細胞の走化性研究のために通常は十分ですが、追加の周波数が他のコンテキスト12,13に情報を提供することがあります。 </li><li>合計テスト期間は、右手に、設定することができますパネル、または実験は、細胞が電極に到着の指標である抵抗を作り出した後、 &quot;Finish&quot;をクリックして、手動で停止することができます。細胞が電極に到達するのにかかる時間は、使用する細胞の種類によって異なります。 </li><li>データ収集を開始する &quot;スタート&quot;をクリックします。 </li></ol> 7。データ管理<ol><li>データはExcelにエクスポートすることもできますが、ECISθシステムに付属のECIS 1600Rソフトウェアは、留学生センター/タクシーデータを分析するための最も効率的な方法です。 </li><li>ソフトウェアのデータ解析ツール·バー、ラジオボタンが含まれているZ、R、Cのこれらは、それぞれのインピーダンス、抵抗、容量かどうかを判断するには、x軸（経過時間）に対する縦軸にプロットされます。 </li><li> ECIS /タクシーのデータが最も効率的に4000 Hzで時間をかけて抵抗として表示されます。急激な抵抗の変動、またはmicrotransients（ 図1）は 、電極上の細胞の移動の証拠である。 oが、コンパイルそれはデータのmicrotransientsを平均化するので、rのビニングていないすべての点がグラフ化されるように、データポイントは、留学生センター/タクシーはお勧めしません。 </li><li>グラフはECIS1600Rソフトウェアを使用して行われていると、それは、ファイルメニューから &quot;グラフのエクスポート&quot;を選択してエクスポートします。tifファイルまたは。jpgファイルとして保存することができます。 </li></ol> 8。代表的な結果細胞走化性は、4,000 Hzの抵抗の増加によって示されます。ターゲット電極上の細胞の到着にもオップらに記載されmicrotransients、または微動と呼ばれる抵抗の急激な変動の出現によって示されます。ら 、2009（ 図1）14。陰性の結果が一貫性のある、または、 図1に赤で見られる4000 Hzの抵抗がわずかに減少し、で示されています。 microtransientsの欠如はまた、電極に細胞運動の不在の印である。抵抗の増加は、直接プロです。電極10を横断するセル数に比例します。 Gタンパク質共役受容体は走化性11をブロックすることができますに干渉することが知られている化学誘引物質または毒素に特異的なモノクローナル抗体の添加。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> 図1。 SDF1αへの応答におけるヒトJurkat T細胞の走化性。ヒトJurkat T細胞（2.0x10 6細胞/ ml）をネガティブコントロールとしてSDF-1αの勾配にさらされる（濃度100 ng / mlの開始）またはRPMI 1640されました。 4000 Hzの正規化された抵抗は、グラフにしました。抵抗とmicrotransientsの増加によって証明されるようには動きはRPMI 1640への暴露でみられなかったヒトJurkat T細胞は、SDF-1αに応答して移動した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> 図2。 ECIS /タクシーのトップビューには、withou、電極tは、アガロース、各留学生センター/タクシー電極は、8個のチャンバーで構成されています。各チャンバは、大きな電極（）を共有し、個々のターゲット電極（B）が含まれています。各チャンバには、カニューレとアガロースのウェルを切り出す際のガイドとして使用されている2ゴールドサークル（c）を、持っています。金の正方形（d）は電極に交流電流を適用するためにポゴ·ピンに接続する接触パッドです。個々のターゲット電極は大きなカウンター電極（e）の各回路である。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> 図3。二つのウェルズは、各アガロース充填室にカットされています。化学誘引物質が1つに追加された場合もそれはよく誘引物質に最も近い化学的に誘引するの最高濃度で、アガロースのグラデーションを作成する拡散。細胞は、化学誘引物質の高濃度に向かってアガロースの下に移動するとターゲット電極上に渡すことができます。として細胞は、ターゲット電極を渡り、抵抗の増加はECIS 1600Rソフトウェアによって記録されています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> 図4。プレキシガラスに2つの14ゲージのカニューレを挿入する。 A）5/64 &quot;ドリルビットは、カニューレの先端をシャープにするために使用されます。B）二つの穴が、レイアウトショットによると14ゲージのカニューレを収容するためにプレキシガラスに掘削する必要があります。C）の穴を確保するためにドリルプレスを使用して垂直であるpleixglass面。D）への2つの尖ったカニューレは、¼ &quot;プレキシガラス、離れて2ミリメートル（内側のエッジから測定）を介して挿入されます。これらの尖ったカニューレは、慎重に井戸を切るためにアガロースに挿入されます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> 図5。 ECIS /タクシーチャンバー内の金ドットでカニューレを合わせます。ウェルをカットするには、尖ったカニューレはそうしなければなりませんECIS /タクシーチャンバーの底部にターゲット電極に隣接する金のドットと整列することができます。カニューレは、任意の水平移動することなく、垂直に挿入し、同じ方法で削除する必要があります。

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デビッド·クネヒト、マイケル·Lynesは、応用物理学、Inc。にコネチカット大学にライセンス供与されECIS /タクシーテクノロジの発行された特許を持っている

ECIS /タクシーアッセイの小説の特性は、細胞が走化性因子に応答するようにリアルタイムデータの収集を自動化する能力が含まれています。この技術の最もありふれたアプリケーションは、個々の走化性勾配に、または走化性のアゴニストおよびアンタゴニストの混合物から成る勾配に対する細胞応答を測定することですが、留学生センター/タクシーのアプローチはまたで非常に有用であ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> ECISZθ </td><td>応用物理学</td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS電極アレイ</td><td>応用物理学</td><td> 8W走</td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTGアガロース</td><td> BioWhittaker分子のアプリケーション</td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10から040 </td><td></td></tr><tr><td>ハイクローンウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> PEnicillin /ストレプトマイシン</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 1670049 </td><td>ペニシリン5,000 IU / mlで、ストレプトマイシン5 mg / mlの</td></tr><tr><td> HEPESバッファー</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 1688449 </td><td> 1M溶液、細胞培養グレード</td></tr><tr><td> 14ゲージステンレス製カニューレ（2）4インチ</td><td>一般的なラボサプライ</td><td> 5-8365-1 </td><td>ブラントポイント</td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

外部刺激に応答して細胞の動きは、創傷治癒、炎症や感染症への対応を含む多くの細胞プロセスの基本である。走化性を測定するための一般的な方法は、細胞と化学誘引物質が多孔質膜で区切られたボイデンチャンバーアッセイである。細胞が走化性因子に向かって膜を介して移行するように、彼らは、膜の底面に付着し、または基礎となるメディアに分類され、その後、染色し、視覚的に1カウントされます。この方法では、細胞組織2で見つけた勾配の貧しい表現であると考えられている急と一時的な走化性勾配にさらされている。 別のアッセイ系、下のアガロース走化性アッセイ、3、アガロース層を形成し、薄い水性膜の固体基板全体の4小節の細胞運動。アガロースに発症勾配が浅く、アプリであると考えられている自然勾配を発生するの表現をropriate。走化性は、走行距離の顕微鏡イメージングにより評価することができる。 Boydenチャンバーアッセイと下のアガロースアッセイの両方は、通常、エンドポイントアッセイとして設定されています。 自動化された留学生センター/タクシーシステムは、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）5、6アンダーアガロースのアプローチを組み合わせたものです。このアッセイでは、ターゲット電極は、8室の各々に配置されています。大対向電極は、8室（ 図2）のそれぞれを介して実行されます。各チャンバは、アガロースを充填し、二つの小さな井戸は、ターゲット電極の両側にアガロースにカットされています。他の拡散誘引物質の発生源（ 図3）を保持しながら、一つはよく、試験細胞集団で満たされている。システムを通過する電流は、細胞がターゲット電極を通過として発生する抵抗値の変化を決定するために使用することができます。ターゲット上の細胞はelectrod電子システム6の抵抗を増加させる。さらに、抵抗の急激な変動は、電極表面と細胞の相互作用の変化を表しており、継続的な細胞の形状変化を示すものである。 ECIS /タクシーシステムは、長期間にわたって、リアルタイムで細胞集団の動きを測定するだけでなく、ターゲット電極で単一のセルの到着を検出するのに十分な感度であることができます。 細胞性粘菌discoidiumは、葉酸勾配7、8の存在下で移行することが知られており、その走化性応答が正確に留学生センター/タクシー9によって測定することができます。白血球走化性は、SDF1αへと走化性拮抗薬への応答にも留学生センター/タクシー10、11で測定されています。 SDF1αへの白血球の応答の例を図1に示されています。

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

ECIS /タクシーシステムは、細胞走化性を測定する自動化された、リアルタイムのアッセイである。このアッセイにおいて、細胞は、ターゲット電極に到達するためにアガロースの層の下に移動します。携帯電話の動きはAC電流0〜抵抗の発症によって測定されます。

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K ビュー.  University of Connecticut. ECIS /タクシーシステムは、細胞走化性を測定する自動化された、リアルタイムのアッセイである。このアッセイにおいて、細胞は、ターゲット電極に到達するためにアガロースの層の下に移動します。携帯電話の動きはAC電流0〜抵抗の発症によって測定されます。

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Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

生物学

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...