我々のプロトコルは、単球およびマクロファージおよびT細胞およびそれらの関連サブセットをニューロンおよびオビウムおよび免疫系の様々な他の組織内で詳細に同定し、分析することを可能にする。我々の技術は、変形性関節症免疫応答の包括的な特性評価のための滑膜および他の関連組織からの生命免疫細胞の信頼できる収穫を促進する。変形性関節症モデルマウスから目的の組織を分離するために、マウスを上弦の位置に、胸、腹部および脚を70%エタノールで拭く。
腹腔をそのままにしたまま、腹部の正中線に沿って皮膚を慎重に開くには、はさみを使用してください。そして、動物の右側の皮膚を下の筋肉からそっと引っ張り、皮下脂肪組織を皮膚に取り付けたままにします。マウスを解剖顕微鏡の下に置き、2つの湾曲した細かい鉗子を使用して、太ももに位置する脂肪組織を優しくいじめます。
3つの十字船を特定した後、細かい解剖鉗子を使用して、血管の交点にあるリンパ節を取り除き、カプセルを破裂させないように注意する。鉗子を使用して、残りの脂肪をリンパ節の表面から取り除き、腹腔を開きます。残りの脂肪が見えない場合は、リンパ節を以前に調製し、0.5ミリリットルのRPMI培地で満たされた6つのウェルプレートに直ちに配置します。
以降、腹腔を開く。細かいはさみを使って脾臓を切除し、腸を優しく抽出して大腸とその分岐を露出させる。以下、前に準備した6つのよく再生されたRPMI培地に直ちに脾臓を置く。
腹部大動脈の末端部に位置する腸骨リンパ節と共通の腸骨動脈の起源を取り除き、両方の後肢から皮膚を慎重に取り除く。すぐに前に準備され、2つの動物からすべてのリンパ節をプールするRPMI培地の0.5ミリリットルでラベル付けされた6つのウェルプレートビルドにリンパ節を置きます。細かいはさみやメスを使用して、付属の筋肉組織の左大腿骨をきれいにし、慎重にスティフレと股関節の両方を切断し、大腿骨を取り除きながら骨全体をそのまま残します。
その後、以前に調製された6つのウェルプレートに大腿骨を入れ、0.5ミリリットルのRPMI培地で満たされた6つのウェルプレートにラベルを付けた。右の息苦しい関節の膝蓋腱を特定し、膝蓋骨に近い四頭筋腱の約5ミリリットルが露出するまで、接合する筋肉組織近位の関節を取り除くために細かいはさみを使用する。膝蓋骨に近い約3〜4ミリメートルの四頭筋腱を切断してハンドルを形成し、細かい鉗子を使用して関節から緊張をそっと引き離し、関節カプセルアタッチメントの端を露出させます。
大腿骨から始まり、脛骨に向かって移動し、メスを使用して両側の関節カプセルの端に沿って慎重に切断し、四頭筋腱の穏やかな牽引力を維持します。滑膜組織ブロックが脛骨にのみ付着する場合、関節内脂肪パッドは膝蓋骨に遠位にはっきりと見えるようにし、ミンスキーの関節および前側面から穏やかに切り離すことができる。次いで、関節カプセルの残りの部分に沿って切断し、滑液組織ブロックを除去し、すぐにそれを以前に調製した6つのウェルプレートに配置し、1.5ミリリットルのRPMI培地で満たされたラベル付けした。
すべての組織が採取されたら、条件ごとに2つのプールされた脾臓を15ミリリットルチューブの70マイクロメートル細胞ストレーナーに置き、無菌3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーを頻繁に洗い流すメッシュフィルターを通して組織を穏やかに質量評価し、RPMI 1640培地の合計6ミリリットルで頻繁に組織を質量レートします。遠心分離により細胞を沈下し、5ミリリットルの赤血球リシスフグ中にペレットを再懸濁させた。5分後、PBSの10ミリリットルで反応を停止し、細胞を遠心分離します。
赤血球がこれ以上観察されない場合, カウントのための新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再中断.リンパ節処理の場合、4つのリンパ節すべてを新しい15ミリリットルチューブの70マイクロメートル細胞ストレーナーに配置し、新しい無菌3ミリリットルプランジャーを使用してメッシュを通してリンパ節を単一の細胞懸濁液に優しくいじめ、5分間Gの500倍の細胞を遠心し、上澄み物を捨て、ペレットを500マイクロリットルで再中断します。骨髄を分離するには、組織の親指鉗子を使用して無傷の大腿骨を慎重に把握し、鋭利なはさみを使用して近位大腿骨の端を切断します。
大腿骨の間音のノッチの中央に23ゲージの針を挿入し、ノッチに穴を開けるために穏やかな圧力を加えながら針を回します。必要に応じて針を変更し、新しい15ミリリットルチューブ上の70マイクロメートルセルストレーナーに10%FBSを補ったRPMIの6ミリリットルで骨の内容物を洗い流し、新しい3ミリリットルシリンジプランジャーを使用してメッシュを通して骨髄を穏やかに押し込みます。以降、脾臓について実証したようにRBCステップを行う。
赤血球がこれ以上観察されない場合, カウントのための新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再中断.滑液組織の処理のために小片に2つの滑液組織ブロックをサイコロに微細な外科用はさみを使用し、新しい15ミリリットルのチューブにサンプルを移す。500マイクロリットルの培地で回収容器をすすい、残りの細胞と滑液組織を採取し、サンプル採取管で洗浄液を引っ張ります。
次に、1ミリリットルの最終濃度で達成するのに十分な量の酵素を加え、2時間の回転子のインキュベーターで37°Cで滑液組織サンプルを消化する。チューブを回転器に入れる際には十分な動きを確認してください。インキュベーションの終わりに、10%FBSで補ったRPMIの8ミリリットルで消化を停止し、新しい15ミリリットルチューブに70マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液を濾過します。
古い15ミリリットルのチューブを5ミリリットルの媒体で洗い流し、これを使用してフィルターを洗浄します。次いで、遠心分離により細胞を沈下し、500マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁してカウントする。単離された免疫細胞の生存性染色を行うために、各細胞懸濁液の5つの細胞に5倍10を加えて、2つの異なる96ウェルUボトムプレートの適切なウェルに細胞を加え、各ウェルの底部に細胞を集める。
各組織タイプの十分な染色されていない細胞を常に陰性対照として含む。200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの細胞で再懸濁し、光から保護された摂氏4度で15分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき200マイクロリットルのFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、適切な目的の抗体または対照カクテルの100マイクロリットルの各ペレットを再懸濁します。
細胞内染色と細胞外染色の両方が同じで行われる場合は、今すぐ細胞外染色工程を行う。光から保護された摂氏4度で30分間のインキュベーションの後、細胞をウェルあたり200マイクロリットルのFACSバッファで2回洗浄し、1ミリモルEDTAを補ったFACSバッファーの250マイクロリットルで細胞および単球サブセットパネルプレートを再中断する。細胞内染色が計画されていない場合にのみ、このステップを実施し、それ以外の場合はプロトコルの細胞内染色の側面に進みます。
次に、各単球サブセットサンプルを、光から保護された氷上の適切な対応するFACSチューブに移す。T細胞サブセットパネルセルの細胞間染色の場合、適切な固定および透過性キットから200マイクロリットルの固定バッファーのペレットを、光から保護された摂氏4度で40分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、200マイクロリットルの透過性洗浄バッファーで細胞を2回洗浄し、目的の適切な抗体またはコントロールカクテルの100マイクロリットルでペレットを再中断し、光から保護された摂氏4度で40分間インキュベーションします。
次いで、1回の洗浄液のパーメビライゼーション洗浄バッファーの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄する。そして、光から保護された氷の上の適切な対応するFACSチューブにサンプルを移す前に、FACSとEDTAバッファーの250マイクロリットルで細胞を再中断します。ここで、DMM処理動物の骨髄から集められた免疫細胞上の単球サブセットパネルに対する階層格数戦略が観察できる。
染色されていないトロールは、死んだ生きている汚れの真の陰性を決定するために使用することができ、ゲートは実験が必要に応じて行われるたびに調整することができます。この代表的な分析では、免疫細胞を滑液組織から単離し、DMMまたはシャムコントロール手術の6週間後に細胞外表面マーカーで染色した。DMM治療動物では、陰性の手術マウスで観察された細胞集団と比較して、Ly-SC陽性MHC2陰性およびM2マクロファージの割合が高いことが観察される。
ここで、DMM処理動物の脾臓から単離された免疫細胞上の細胞外および細胞内T細胞パネルに対する階層的な格子化戦略が観察できる。TH1細胞の高い割合は、DMM動物のリンパ節および滑液組織だけでなく、T調節細胞およびTH17細胞の数が多い。高品質のサンプルの取得を確実にするために、組織は迅速、細心の注意を払って、一貫した方法で収穫されなければなりません。
免疫細胞が単離されると、他の下流分析は、RTPCR、細胞培養および血液上で休息し、目的の分子プロセスに光を当てるなど、行うことができる。
