現在のプロトコルは、熟練した運動行動の根底にある脳メカニズムの研究に貢献しています。ワイヤレス光遺伝学は、被験者が自由な動きでタスクを実行する間、特定のニューロンの操作を可能にします。高速ビデオ撮影と組み合わせることで、細かい運動挙動の詳細な解析が可能です。
この方法は、神経発達および神経変性障害における運動障害を理解するのに役立つ可能性がある。これらの技術は、他の行動パラダイムにおける脳機能の研究にも使用できます。私の研究室の学部生であるダイアナ・ロドリゲス・ムニョスが実験を手伝います。
外科的処置のために、目的の構造の背腹座標に従って所望の長さのLEDカニューレを準備することから始める。これを行うには、ガラス繊維を最終的な所望のサイズよりも長い長さに切断し、粗いサンドペーパーで繊維先端を目標長さまで粉砕する。次に、繊維先端を細かいサンドペーパーで磨きます。
マイクロインジェクションの場合は、ピペットにミネラルオイルを充填し、ピペットをマイクロインジェクターに入れます。マイクロインジェクターが正常に動作することを確認します ミネラルオイルを注入します。次に、眼科用軟膏を塗布し、トリマーと脱毛クリームで頭皮から脱毛して、麻酔をかけたマウスを手術用に準備する。
次に、8%ポビドンヨウ素と70%エタノールをそれぞれ3回交互に含む綿棒で頭皮を拭きます。消毒後、マウスを定位装置に入れ、頭部を固定し、頭蓋骨が内側 - 側軸および前後軸に水平になっていることを確認する。メスを使用して、矢状軸に沿った目のレベルで頭皮を通して1センチメートルの切開を行います。
その後、皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させ、綿棒で骨膜をきれいにします。生理食塩水と綿棒で頭蓋表面をきれいにし、滅菌吸収性目の槍を使用して表面の出血を解決します。次に、綿棒で2.5%過酸化水素を滴下し、頭蓋骨の縫合糸を目に見えるようにし、より良い基準を得るために数秒間作用させます。
数秒後、きれいな綿棒でその部分を徹底的にきれいにしてください。最終先端径15ミクロンのガラスピペットで、ブレグマとラムダを見つけて、頭蓋骨が前後軸に水平になっていることを確認します。次に、選択した座標の上にある頭皮の基準点をマーカーでペイントします。
基準点では、小さな丸い歯科用ドリルビットで回転工具で頭蓋骨に穏やかな圧力をかけて直径1ミリメートルの開頭術を行います。完了したら、選択した前後座標(AP)と内側-側方座標(ML)に向かって毛細血管を移動します。毛細血管に300〜400ナノリットルのCreE依存性アデノ随伴ウイルス、またはAAV1、D-フロックスチャネルロドプシンmCherryなどのAAVをロードして、関心領域でチャネルロドプシンを発現させる。
AAVをレポータータンパク質を発現させるための対照として用いることができる。先端が詰まっていないことを確認した後、背側線条体の背側 - 腹側座標を引いた3.35ミリメートルの脳にガラスピペットを導入し、自動注射器を使用して200ナノリットルのウイルスを毎秒23ナノリットルの速度で注入する。こぼれないように、ガラスピペットをゆっくりと引き抜く前に、注射後10分間待ってください。
その後、綿棒で残留物をきれいにして乾かします。次に、ガラスLEDカニューレを定位アームに取り付け、ブレグマを基準として座標を校正します。次に、組織の損傷を避けるためにカニューレをゆっくりと挿入し、注射部位の100マイクロメートル上に置きます。
LEDカニューレが所定の位置に収まったら、開頭術の端に100マイクロリットルの組織接着剤を滴下します。滅菌ブラシを使用して、カニューレコネクタの周りに新しく調製した歯科用セメント混合物を少しずつ塗布し、頭蓋骨が覆われてコネクタが頭蓋骨にしっかりと取り付けられ、ピンが完全に自由になるまで層を構築します。セメントが完全に乾いたら、組織接着剤を使用してインプラントの周りの皮膚を閉じます。
次に、マウスを摂氏33度の加熱パッドの上の回復ケージに入れ、不快感や痛みの兆候を監視します。通常のカメラで動物の行動を記録し、チャンバーの正面から毎秒30〜60フレームをキャプチャします。訓練室の下に45度の角度で鏡を配置して、動物の姿勢を監視することができます。
マウスがペレットに到達し始めたら、リモコンでLEDカニューレを手動で回して、行動が2秒以内に実行される間、継続的な刺激を与えます。刺激装置は、ミリメートル平方あたり1ミリワットの先端に強度を有する470ナノメートルのLEDをトリガする。光遺伝学的操作下での動物の微細な運動行動を、リーチ・トゥ・把握タスクで研究した。
マウスは数日でタスクを実行することを学び、55%以上の精度を達成し、5日間のトレーニング後にプラトーに達しました。動きの軌跡を高速ビデオ撮影で追跡し、運動学の解析を可能にしました。移動距離、速度、加速度、終点、軌道などのパラメータの定量化可能な評価が行われました。
逃した試験では、マウスはヒット試験よりもペレットから遠く離れたところに把持運動を始めた。さらに、誤差はマウスの姿勢と有意に関連しており、ヒット試験と逃した試験中の身体角度の違いによって示された。棘状突起ニューロン(SPN)を発現するD1ドーパミンの対側活性化は、対照条件と比較して把握の成功を低下させた。
光遺伝学的刺激の間、足の軌道は移動距離において増加し、ペレットを標的とすることができず、初期誤差タイプ1の増加につながった。主成分分析(PCA)は、対側D1 SPN活性化中のすべての試験軌道が、対照クラスターとほとんど重複しないクラスター内で分離し、類似性が低いことを示した。同側におけるDSPNの活性化は、PCA分析によって示される軌道分散の増加をもたらした。
したがって、同側D1 SPNの活性化は、行動の結果を変更することなく、到達軌道を変更した。このプロトコルを実行するときは、トレーニングセッション中にカニューレが外れないように、カニューレを正しく配置するように注意してください。この方法は、運動行動、感覚処理、学習、および記憶を研究するために、他の行動パラダイムで使用することができる。
ワイヤレス光遺伝学は、真に自由に動く被験者における自然主義的行動とその神経生物学的基盤を研究することを可能にするでしょう。
