C.elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの組織特異的発現の使用は、無傷の多細胞生物の文脈におけるプロテオスタシス調節因子の発見および特徴付けが可能であるため、有意である。この技術の主な利点は、生物がプロテオームの適切な折りたたみと機能を維持する方法と老化の影響についてより深い機械学的洞察を得るために不可欠である生体内の細胞プロテオスタシスの年齢関連の減少の視覚化と定量化を可能にすることです。プロテオスタシスを維持できるメカニズムを解明することで、プロテオスタシスが損なわれる老化関連疾患の治療に対する標的介入の開発が促進され、健康な老化を促進する。
プロテオスタシス崩壊は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症を含むタンパク質ミスフォールディング疾患の発症の根底にあるため、大規模なクリニックの問題です。まず、直径6センチのペトリプレートを使用して、各試験条件に対して5枚の寒天プレートを準備します。RNAiの実験のために、変換されたHT115大腸菌でdsRNA産生を誘導し、RNAi寒天を使用する。
RNAiを使用しない実験には、標準NGM寒天にOP50大腸菌を使用してください。220 RPMで揺れながら、大腸菌培養物を摂氏37度で一晩育ててください。翌日、2,400Gで15~20分間遠心分離して細菌をペレット化し、その上清を吸引し、皮質をlbの開始量の10分の1に再び懸濁させる。
アリコート200マイクロリットルの濃縮細菌を各プレートに入れ、すべての液体が吸収されるまで、開放プレートをクリーンな環境で乾燥させます。C.Elegansと次亜塩素酸処理を同期させるには、M9バッファーでグラビッドヘルマフロダイトを2回洗浄し、新鮮なチューブに移し、5ミリリットルの次亜塩素酸溶液で5ミリリットルでインキュベートし、毎分振ります。インキュベーション後、動物をスピンダウンし、M9バッファで3回洗浄します。
胚は摂氏20度の回転でM9溶液の3ミリリットルで一晩チューブで孵化することを可能にする。L1溶液の10マイクロリットルを6センチメートルのプレートに3回落とし、L1動物の数を数えることによって、L1動物の密度を計算します。定期的に、L1溶液を混合して、動物が沈降するのを防ぎます。
シード50 L1は、各プレートに1匹の動物を、数えて、播種数を記録し、プレートを20°Cインキュベーターに移動させます。あるいは、卵のレイを介して動物を同期させるには、5〜10匹の若い大人の動物を各プレートに4〜6時間置き、1皿あたり約50個の卵が存在するまで卵を産ませる。すべての肉付きの大人を削除し、20°Cのインキュベーターに卵とプレートを移動します。
摂氏20度で約40時間かかるL4段階まで動物を育てる。その後、FUDRの160倍の50マイクロリットルを加えます。筋肉組織のプロテオスタシスの減少を測定するには、20匹の動物を選び、3%アガロースパッドと10ミリモルナトリウムアジドの5マイクロリットルの滴で顕微鏡スライドに取り付けます。
すべてのワームが固定化された後、10 X倍率レンズを使用して動物の全身を画像化します。FITCまたはYFPフィルタを使用し、すべての動物に同じ露出を使用してください。終了したら、スライドを破棄します。
動物全体の体壁筋の病巣数を数える。Fociは、バックグラウンドで調光可溶性信号と区別することができるより明るい句読点信号である。採点日には、動物と一緒にプレートを見て、麻痺した動物の数を記録し、プレートから麻痺した動物を取り除きます。
実験が完了したら、各条件の麻痺率を計算し、麻痺の進行をプロットします。神経組織におけるプロテオスタシスの減少を測定するには、先に説明したように、スライド上にワームを取り付け、40 X倍率レンズを使用して動物の頭部のZスタック画像を取ります。イメージング後にスライドを破棄します。
画像を取得した後、Zスタックを平らにし、神経リング領域に位置するニューロンの病巣の数を定量化するためにそれらを使用します。4日目、6日目、8日目、10日目からのYFP病巣蓄積の進行をプロットします。成人期の2日目に、プレートから10匹の同期動物を選び、顕微鏡スライドのM9バッファの10マイクロリットルのドロップに置きます。
40匹以上の動物のサンプルを得るために、このステップを少なくとも4回繰り返します。ビデオは、ビデオ対応カメラでステレオ顕微鏡で30秒間の動物の動きを記録します。分析対象の動物とすべてのビデオが記録されたら、ビデオを再生し、各動物の体の曲がりのスコア。
各ドットが Y 軸で 30 秒以内のボディ ベンド数と X 軸でテストされたさまざまな条件を表す列グラフで、各動物のボディ ベンド数をプロットします。ポリグルタミン反復モデルは、プロテオスタティックネットワークを調節する遺伝子の同定に役立っています。筋肉特異的なポリQ-YFP発現は、単純な蛍光解剖顕微鏡で定量しやすい蛍光病巣の蓄積をもたらす。
レポーターのタンパク質毒性効果により筋肉内のプロテオームが崩壊するため、動物は中生の間に麻痺します。神経細胞質分解の年齢関連の減少は、直接凝集体形成を定量化し、動物を液体に入れた後に協調体の曲がりの減少を続けることができる。この方法は、ホメオドメイン相互作用タンパク質キナーゼ、転写補因子がオートファジーおよび分子シャペロンの発現を調節することによって老化中のプロテオスタシスに影響を与えることを示すために使用されてきた。
HPK-1 の損失により、エージング時に蓄積される Q35-YFP 集計の数が増加します。対照動物は平均18個の凝集体を示し、HPK1ヌル変異体およびHPK1RNAi処置動物はそれぞれ平均28および26の凝集体を示した。成人期の8日目までに、HPK1欠乏動物の77〜78%が麻痺したのに対し、対照のわずか50%であった。
さらに、HPK1の過剰発現は、タンパク質凝集体形成を調節し、老化時にQ35-YFP関連麻痺から老化動物を保護することが実証された。この方法は、細胞型内のプロテオームの一般的な衰退を測定する。立立腺ネットワークの特定のコンポーネントの変化を評価する方法は数多く存在します。
一緒に、彼らは包括的な画像を提供します。プロテオスタシスの低下は老化の特徴です。このアプローチは、研究者がこの減少を定量化することを可能にします。
遺伝子解析と組み合わせると、発見のための強力なツールです。
