タンパク質凝集のメカニズムは、これまでのところ、主にインビトロで調査されてきた。我々のプロトコールにより、モデル生物C.elegansで同様の定量的研究を行うことができます。我々の方法の主な利点は、包含数の偏りのない定量化である。
そして、これらの高品質のデータを数学的モデルに当てはめることで、集約メカニズムへの洞察を得ることができます。タンパク質凝集は、アルツハイマー病およびハンチントン病を含む多くの疾患で起こる。生体内でのタンパク質凝集の分子機構を理解することは、新しい治療法を開発する上で極めて重要です。
まず、10匹の成虫線虫をプラチナワームピックで6cmの播種NGMプレートの上に置き、同期産卵を行います。成虫を20°Cで約2時間産卵させてから、プレートから取り出します。卵を入れたプレートを20°Cのインキュベーターに入れ、産卵後約3日目に成虫になるまで動物の発達を監視します。
麻酔薬として25 mMアジ化ナトリウムを添加した100 LのM9バッファーで必要な数のウェルを充填することによって、384ウェルプレートを調製する。画像化する株ごとに1つのウェルを充填します。各株について、プラチナワームピックを使用して20匹の動物を1つの井戸に移します。
蒸発を防ぐためにプレートを蓋で覆い、準備後1時間以内にプレートをイメージします。計測器の電源を入れ、ソフトウェアを開きます。「ウェルプレートをアンロード」の横にある「再生」ボタンをクリックし、384ウェルプレートを顕微鏡に置きます。
「アクションリストと 3D 蛍光取得」で、「テスト」をクリックし、ワームを含むウェルを選択します。「画像処理」を「なし」に設定します。また、[再生]ボタンをクリックして、ワームが正しく中央に配置される最適なシフト距離を決定します。
「上昇距離」を「上り距離」を「下降距離」を「50 m」に、「スライス間隔」を「2 m」に設定して、Z スタック内の動物の厚さ全体をキャプチャします。画像処理を最大値に戻します。「ウェルプレートスキャン設定」で画像化するウェルを選択します。
そして、タイルと全体の井戸を取得を選択します。測定設定を保存します。[測定の開始] をクリックして実験を開始します。
CellProfiler を開き、パイプラインを [パイプライン ファイルをここにドロップ] ウィンドウにドラッグします。「はい」をクリックしてプロジェクトをロードします。次に、ステッチされた画像を[ここにファイルとフォルダをドロップ]ウィンドウにドラッグします。
メタデータ入力モジュールをクリックします。正規表現を調整して、ステッチされた画像の名前に従ってファイル名から抽出します。NamesAndType 入力モジュールをクリックし、ファイル名のチャンネルに一致するように [ルール条件の選択] を調整します。
次に、[出力設定]をクリックして、CellProfilerからの出力を保存するフォルダを選択します。[テストモードの開始]をクリックして、最初のイメージングデータセットを使用してパイプラインの設定を確認します。[ステップ] をクリックして、パイプラインを一度に 1 つのモジュールで実行します。
ワームのアウトラインを調整するには、EditObjectsManually モジュールの [ヘルプの表示] をクリックして手順を確認します。アウトラインを修正します。次に、[完了] をクリックしてパイプラインの実行を続行します。
[テストモードの終了]をクリックし、画像を分析します。出力フォルダを開いて、出力ファイルを表示します。そして、元のファイル名に続いてアウトラインで画像を開き、ワームとインクルージョンが正しくオーバーレイされているかどうかを確認します。
AmyloFit の使用を開始するには、プロジェクトに名前を付けて [プロジェクトの作成] をクリックします。[開く]をクリックして開きます。そして、セッションに名前を付けて[セッションの作成と読み込み]をクリックしてセッションを作成します。
[データの追加] をクリックし、左側のパネルに表示されるデータ形式の要件に従って、動物あたりの平均包含物数を含むファイルをアップロードします。次に、[新しいデータの読み込み]をクリックします。0 点オフセットで平均するポイント数を 0 に設定し、プラトーの平均点数を 0 に設定して、包含カウント データに不要な前処理ステップをスキップします。
次に、[送信]をクリックします。タンパク質濃度ごとにこの手順を繰り返します。モデルパネルで「カスタム」を選択します。
独立核生成の方程式を「方程式」ボックスに入力します。[モデルの読み込み] をクリックします。Ncellsの場合、パラメータタイプをグローバル定数に設定し、体壁筋細胞の数に対応する値を95に設定します。
パラメーターの型を Kcell および n のグローバル適合に設定します。そしてmに対して定数とする。左パネルに異なるひずみのmの値を入力します。
流域ホップの数は変更せずに、継ぎ手パネルの「適合」(Fit) をクリックします。最後に、データと適合のダウンロードをクリックして適合値を抽出します。包含数を、異なるQ40濃度を発現する4つのC.elegans株においてモニターした。
独立核生成モデルは、凝集動態をよく記述する。適合は、1mMの細胞内タンパク質濃度で、2.1の反応オーダー、および細胞当たり1日当たり0.38分子の核生成速度をもたらした。以前の研究における2つの独立した生物学的反復は、反応順序および核生成速度について密接に対応する値を示した。
留意すべきことの1つは、信頼できる適合を得るためには、複数のタンパク質濃度に対して高品質のデータセットが必要であるということです。この方法は、遺伝子ノックダウンや小分子治療など、生体内のタンパク質凝集を妨害する方法を見つけるために使用することができる。
