Использование тканеспецифической экспрессии флуоресцентного репортера полиглутамина в C.elegans имеет большое значение, поскольку позволяет обнаружить и охарактеризовать регуляторы протеостаза в контексте интактного многоклеточного организма. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет визуализировать и количественно оценивать возрастное снижение клеточного протеостаза in vivo, что необходимо для получения более глубокого механистического понимания того, как организмы поддерживают правильное сворачивание и функцию протеома и эффекты старения. Выяснение механизмов, способных сохранить протеостаз, будет способствовать разработке целенаправленных вмешательств для лечения заболеваний, связанных со старением, при которых протеостаз скомпрометирован, и для содействия здоровому старению.
Коллапс протеостаза является огромной клинической проблемой, поскольку он лежит в основе развития заболеваний, неправильно сворачивающих белок, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз. Начните с использования пластин Петри диаметром 6 сантиметров, чтобы подготовить пять агаровых пластин для каждого условия испытания. Для экспериментов с РНКи индуцируйте продукцию дцРНК в трансформированной HT115 E.coli и используйте РНК-агар.
Используйте OP50 E.coli на стандартном агарове NGM для экспериментов без RNAi. Выращивайте культуры E.coli в течение ночи при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 220 оборотах в минуту. На следующий день гранулируют бактерии центрифугированием при 2 400 г в течение 15-20 минут, затем аспирируют супернатант и повторно приостанавливают гранулу в одной десятой от начального объема фунта.
Aliquot 200 микролитров концентрированных бактерий на каждую пластину и позволяет открытым пластинам высыхать в чистой среде до тех пор, пока вся жидкость не впитается. Чтобы синхронизировать C.Elegans с обработкой гипохлоритом, дважды промыть гравидные гермафродиты буфером М9, затем перенести их в свежую трубку и инкубировать в 5 миллилитрах раствора гипохлорита в течение пяти минут, встряхивая их каждую минуту. После инкубации открутите животных и трижды вымойте их буфером М9.
Дайте эмбрионам вылупиться в трубках на ночь в 3 миллилитрах раствора М9 с вращением при 20 градусах Цельсия. Рассчитайте плотность животных L1, опустив 10 микролитров раствора L1 три раза на 6-сантиметровую пластину и подсчитав количество животных L1. Периодически смешивайте растворы L1, чтобы животные не осетели.
Посейте 50 L1 одного животных на каждую тарелку, подсчитайте и запишите количество посеянных и переместите пластины в инкубатор с 20 градусами Цельсия. В качестве альтернативы, чтобы синхронизировать животных через яйцекладку, поместите от пяти до десяти молодых, гравидных взрослых животных на каждую тарелку в течение четырех-шести часов и позвольте им отложить яйца, пока на тарелку не будет примерно 50 яиц. Удалите всех взрослых особей и переместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 градусах Цельсия.
Выращивайте животных до стадии L4, что займет примерно 40 часов при 20 градусах Цельсия. Затем добавьте 50 микролитров в 160 раз больше FUDR. Чтобы измерить снижение протеостаза в мышечной ткани, выберите 20 животных и установите их на слайд микроскопа с 3% агарозной прокладкой и 5-микролитровой каплей 10-миллимолярного азида натрия.
После того, как все черви обездвижены, визуализируем все тела животных с помощью 10-кратной увеличителяемой линзы. Используйте фильтр FITC или YFP и одинаковую экспозицию для каждого животного. По завершении отбросьте слайды.
Подсчитайте количество очагов в мышцах стенки тела всего животного. Фокусы представляют собой более яркие прерывистые сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала в фоновом режиме. В дни подсчета очков посмотрите на тарелки с животными и запишите количество парализованных животных, а затем извлеките парализованных животных из тарелки.
По завершении эксперимента рассчитайте частоту паралича для каждого состояния и постройте график прогрессирования паралича. Чтобы измерить снижение протеостаза в нейронной ткани, установите червей на слайд, как описано ранее, и сделайте Z-образные изображения головы животных на составном микроскопе с использованием линзы с увеличением 40 X. Удалите слайды после создания изображения.
После получения изображений сглаживайте Z-стеки и используйте их для количественной оценки количества очагов в нейронах, расположенных на области нервного кольца. График прогрессирования накопления очагов YFP с 4, 6, 8 и 10 дней. На второй день взрослой жизни выберите 10 синхронизированных животных из тарелки и поместите их на 10-микролитровую каплю буфера M9 на слайде микроскопа.
Повторите этот шаг по крайней мере четыре раза, чтобы получить образец из 40 или более животных. Видеозапись движения животных в течение 30 секунд на стереомикроскопе с видеокамерой. После того, как все видео с животными, которые будут проанализированы, будут записаны, воспроизвести видео и забить изгибы тела каждого животного.
Отрисуйте количество изгибов тела для каждого животного в столбцовом графике, где каждая точка представляет количество изгибов тела за 30 секунд по оси Y и различные условия, протестированные на оси X. Модель повторения полиглутамина сыграла важную роль в идентификации генов, которые регулируют протеостатическую сеть. Мышечно-специфическая экспрессия polyQ-YFP приводит к накоплению флуоресцентных очагов, которые легко поддаются количественной оценке с помощью простого флуоресцентного рассекающего микроскопа.
Животные становятся парализованными в среднем возрасте, так как протеом внутри мышцы разрушается из-за протеотоксического эффекта репортера. Возрастное снижение нейронного протеостаза может сопровождаться непосредственной количественной оценкой образования агрегатов и снижения скоординированных изгибов тела после помещения животных в жидкость. Этот метод был использован, чтобы показать, что гомео-домен, взаимодействующий с протеинкиназой, транскрипционным кофактором, влияет на протеостаз во время старения, регулируя экспрессию аутофагии и молекулярных шаперонов.
Потеря HPK-1 увеличивает количество агрегатов Q35-YFP, которые накапливаются во время старения. Контрольные животные показали в среднем 18 агрегатов, в то время как животные, обработанные нулевым мутантом HPK1 и HPK1 RNAi, показали в среднем 28 и 26 агрегатов соответственно. К восьмому дню взрослой жизни от 77 до 78% животных с дефицитом HPK1 были парализованы, по сравнению с 50% контрольной группы.
Кроме того, было продемонстрировано, что сверхэкспрессия HPK1 регулирует образование белковых агрегатов и защищает стареющих животных от паралича, связанного с Q35-YFP, во время старения. Этот метод измеряет общее снижение протеома в пределах типа клеток. Существует множество методов оценки изменений в конкретных компонентах простатической сети.
Вместе они дают всеобъемлющую картину. Снижение протеостаза является отличительной чертой старения. Этот подход позволяет исследователям количественно оценить это снижение.
В сочетании с генетическим анализом это мощный инструмент для открытий.
