ショウジョウバエは、制御された遺伝的背景と環境条件の下でアルコール感受性を正確に定量することができるため、アルコール感受性の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルを提供します。ハエのショウジョウバエ試験群におけるアルコール感受性を測定する現在の方法。大量の単一ハエでアルコール感受性を評価するための、シンプルで低コストで高スループットの方法を提示します。
ショウジョウバエのアルコール感受性の変動は、ハエがヒトのオルソログと遺伝子の約75%を共有するため、ヒトでも同様の型に変換することができます。我々が開発したアッセイは、他のハエ種や疾患ベクターを含む他の昆虫に対する揮発性物質の急性毒性の影響を測定するためにも適用することができる。まず、24 ウェル細胞培養プレートの段ボールテンプレートを作成します。
プレートの周りをトレースし、指定された領域を切り取ります。次に、段ボールテンプレートを使用して、プレートのサイズをメッシュする小さな昆虫スクリーンの部分を作成します。24ウェルの培養プレートの周囲に熱い接着剤の小さなラインを置き、井戸の上にスクリーンメッシュを貼り付けます。
その後、熱い接着剤銃を使用して、文化プレートの3つの側面に木製のクラフトスティックを固定します。撮影室に収まる限り多くのプレートを準備します。撮影室を作成するには、ポリスチレンボックスの片側にビデオカメラレンズのサイズの穴を開け、反対側のイルミネーションパッドのサイズにスリットを追加します。
照明パッドをスリットに挿入し、カメラを照明パッドの上のレンズホールに置きます。すべての試験材料を制御された環境に置き、好ましくは約30%の湿度、摂氏温度25度、均一な気流、および65デシベル未満の騒音レベルを有する行動室に置きます。チーズクロスを2枚カットするには、以前に作られた段ボールテンプレートを使用します。
その後、スクリーンメッシュを通して100%エタノールの1ミリリットルを各ウェルにピペットします。メッシュを乾かして、チーズクロスを上に2枚置きます。短い側面の1つに1〜2センチメートルの面積を拡大するためのガイドとして段ボールテンプレートを使用して、薄い、柔軟な、プラスチック製のまな板の小片をカット。
切断後、プラスチックはまだ試験装置上の3つの木製のクラフトスティックの間に収まるが、一方の端をハングアップすることを確認してください。原稿の指示に従って吸引器を準備し、それを使用して24ウェル細胞培養プレートに井戸あたり1つのハエを移し、以前に吸引されたハエを柔軟なプラスチックで覆います。各フライのウェル位置と関連する遺伝子型または表現型情報を記録します。
ハエを含む細胞培養プレートの上部にフレキシブルなプラスチックフラッシュを保持し、エタノールで改変された細胞培養プレートの上部にプレートを反転させます。クラフトスティックを使用して反転した細胞培養プレートを整列させ、エタノールの各ウェルがハエを含む各井戸と一致していることを確認します。照明パッドが明るさで点灯していることを確認し、ビデオカメラで録画を開始します。
2枚のプレートの間にプラスチックを慎重に取り除き、チーズクロスを外さないようにして、ハエをエタノールにさらす。すべてのハエが姿勢制御を失った疑いがある場合は、プレートの中央をしっかりとタップします。動きがある場合は、動きが起こらないまで1〜2分ごとにタップして、記録を続けます。
動きがななくなったら、録音を終了します。ハエを回収するには、試験装置から天板を取り出し、個々のハエを選択した容器に吸引する。修飾された細胞培養プレート内のエタノールを少なくとも1時間に1回交換して、アッセイ全体で一貫したエタノール暴露を維持し、必要な数のサンプルについて実験を繰り返す。
ビデオ録画を見て、フライが姿勢制御と運動能力を失う瞬間として定義されるフライセドレーション時間を決定します。正確さを確保するために、逆にフィルムを見て、フライが動き始める時間を記録します。この方法を使用すると、10 分以内に多数のハエに関するデータを生成できます。
2つの24ウェルプレートを使用して、アルコールに対する感度が異なる2つのDGRPラインの48個のハエに対するエタノール沈め時間を同時に測定しました。サンプルサイズが大きいほど精度が向上し、環境変動に対する誤差が低減します。RAL_555ハエはRAL-177ハエよりも感度が低かった。
RAL_177の男性と女性は性的に二型効果を示さなかったのに対し、ラインRAL_555の女性は男性よりもエタノール暴露に対して感受性が低かった。このプロトコルを試みるとき、所望の結果を達成するためには、ハエの吸引と細胞培養板の反転を正確に行うことが重要です。単一のハエを評価する能力は、グループ相互作用による交容効果を回避するので、このアッセイはアルコール暴露の急性効果に関するハイスループット研究のためのショウジョウバエモデルの有用性を高める。
