この研究のための資金は、フロリダ州立大学医学部の大学と旧ソ連の生物科学省からのサポートから神経科学賞は、プログラムによって提供された。追加資金は、補助金のアルコール飲料メーカーの研究基金から提供された。

フライの1。組み立て根拠と概要：システムがハエにアルコール蒸気の制御された割合を管理するために設計されています。注： 図1は、フライの概略図にセットアップ三段階（アルコールと水のボトルの空気流、セットアップのアセンブリ、および観察バイアルの組み立て）は、以下に記載されるように提供する。要するに、安定した空気流は、それぞれ、アルコールと水を通して泡立て混合し、4観測バイアルに投与される2つの画分に分割される。 <ol><li>エアフローの組み立て<ol><li> Yコネクタを使用した一貫性のある空気の流れや分割を生成するために、建物の空気や水槽の曝気装置のいずれかに柔軟なシリコンチューブの短い部分を接続します。システム（4観測バイアル通常千ミリリットル/分）を通過する空気の総量をコントロールし、空気流量調節器への最初の分岐を接続します。 </li><li>第二の管にクイックコネクタを挿入します空気流は、較正された空気の流れに影響を与えることなく、実験の開始時に中断することができる。 Yコネクタを追加し、気流調整器に、各分岐チューブを接続してください。 </li><li>気流規制当局にチューブを接続し、2気流メーターを接続します。 </li></ol></li><li>アルコールと水ボトルのセットアップ<ol><li>気流メートルの出口にフレキシブルチューブを追加し、チューブのそれぞれの長さの端部に90°曲げて細いガラス管（1ミリリットルのガラスピペットの各セクション）を挿入します。これは、水とアルコールのボトルへの入口空気流となる。 </li><li>アルコールと水で満たされたボトルにそれらを介して2穴にゴム栓を配置します。水浴を用いて周囲温度よりも高い一定温度2℃の両方のボトルを保管してください。水浴は27℃である間に我々の実験では、環境室を25℃に維持されている</li><li> Aのストレートガラスピペットを挿入赤外線は、ゴム栓を介して入口とボトルの底から約1cmまでの流体中に延びている。 </li><li>ガラスの終わりはボトル内部ストッパーの下部と同じ高さになるまで、ゴム栓に残っている穴にガラスピペットの肘部分を挿入します。チューブのもう一つの長さが、この空気出口を挿入します。 </li><li> Yコネクタを使用して空気の流れを再結合し、2ツ穴ゴム栓を通して挿入曲げガラスピペットのセクションで空の混合フラスコやボトルを通る空気の流れを導くようにシリコンチューブの別の長さを使用しています。コンセント混合気流のためのシリコンチューブの別の長さを使用しています。 </li></ol></li><li>観測バイアルの組立<ol><li>複数の観測バイアルを各実験で使用できるように、空気の4または8より小さいストリームを得るために混合し、フラスコ2〜3倍から出てくる出口空気流を分割する。観察用バイアルへの柔軟なシリコンチューブを接続します。 </li><li> observatiを設定ガラス管は、アルコール蒸気のための入口および出口を提供する介して2つの孔を含有するゴム栓で密封し、空のバイアルを使用してバイアルに。 </li><li>ネッティングを有する第1のガラス管の端部を覆い、可撓性プラスチックチューブの小片を用いて所定位置にネッティングを保つ。それはバイアルの約半分の長さに伸びるまで、第1の穴を通って、このチューブを挿入します。必要に応じて、ぴったりとフィットを取得するためにテフロンテープを使用しています。 </li><li>それはゴム栓の内側の端と同じ高さになるまでネッティングでカバーの端にも第2のガラス管を挿入します。 </li><li>暗赤色光条件下でハエとのコントラストを最大にするために白い紙の上に水平にバイアルを置きます。 </li><li>気流の適当な画分を混ぜてアルコールに吹き込んや気流が水に吹き込ん。継続的に空気圧を監視し、空気流の所望の混合を維持するために必要に応じて調整を行う。 注：連続運転小さな部屋で、平行または単一のアッセイで複数のフライバーアッセイのアルコール蒸気の顕著な蓄積につながることができます。潜在的に密閉された部屋で研究者に影響を与える可能性があり、アルコール蒸気の継続的なリリースを避けるために、適切なシステムが適切に実験中に生成されたアルコール蒸気を取り除き場所に置かれる必要がある。 、アルコール蒸気を除去し、各バイアルから突出する第2のガラス管にチューブの6-12インチのピースを接続し、それらをバンドルし、漏斗真空システムに向けるために。研究者はまた、実験的な試験室が適切に換気されていることを確認する必要があります。 </li></ol></li></ol>実験動物の2。準備根拠と概要：適切な文化やハエのハウジングは、データのばらつきを減らすことができます。これは、ハエが経験したストレスの標準化と最小化によって達成される。そのため、全く麻酔（CO 2または代替）がドゥリを使用しないNGプロトコルの次のステップのいずれか。さらに、ハエは、年齢は学習と記憶の実験17を含む他の行動の分析のための標準である可変性を最小限にするために、実験および時点間で一致させる必要があります。 異なる光：暗い場所では、エタノールに対する行動応答した体内時計の機能を調べるために使用することができます。日周リズムが存在するかどうかを判断するために、実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために定義されたLDサイクル下で行うことができる。 ZT 12時間点灯が12時12分時間のLDサイクルでオフになっている間、ZT 0は、夜明けを表し、LDサイクルの下のライトの時間として定義されます。一定の条件下では、概日時間（CT）は、環境シグナルの非存在下で動物のための時間を計測する、すなわちフリーランニング時間、および前のLDエントレインメントサイクルに関連している。野生型のショウジョウバエでは、CTは、最初の数日の前のZTを反映している一定のフリーランニング概日期間などの条件やリズム中のSは、〜24時間である。暗サイクル実験前に恒暗条件（DD）に転送：概日変調を測定し、行動に急性光の影響を排除するために、ハエは光に連行される。概日の実験は、特定の概日時間（CT）でのパフォーマンスを測定するために、DDの二日目に行われる。 ショウジョウバエでは、連続光（LL）の条件は、不整脈自発運動18〜21と不整脈短期記憶17によって証明されるように概日コア概日遺伝子の湿らまたは廃止分子振動機能障害や行動概日リズムの崩壊につながる。プロトコルは、概日試験のために最適化されており、他の実験のために簡略化することができる。チューブから12インチで使用される小型の赤いライト;すべての概日の実験は、暗赤色灯（周囲オーバーヘッド赤色光&lt;作業台の上に1ルクスを使用して実施している〜1ルクス光）。 <ol><li>暗い巻き込み条件（LD）：12時12時間の光の下で25℃、リアはハエ。 </li><li> 1日目の日、明期の終わりに新鮮に孵化ハエを収集し、食品の粘着性を最小限に抑えるために、高濃度の寒天食品の少量を含むバイアルを保持している中で、LDの条件で24時間保管してください。注意：ヘルシー、正常に発達ハエを収集するようにするには、羽化が培養瓶の中に開始された後、最初の日以内に収集されたハエを使用しています。 </li><li> （25〜35）は、約30のバッチを集めて光の期間の終わりに向かって2日目に吸引器を使用して飛行する、新鮮な保持バイアルに移す。 </li><li>バイアルの遠端にハエを指示するために、強力な光源を使用してください。行動観察は、各実験の終わりに計数ハエの総数のパーセンテージで報告されるように、この範囲内で、各バイアル中のハエの正確な数は重要ではない。 </li><li> 25°CのFOで、DD条件下でのハエを維持2日間R。 </li><li>実験の日に、さまざまな条件や実験前に少なくとも1時間室温での実験的な行動の部屋以外の保育器に収容されたすべてのハエを置く。順化は、温度や湿度の変化に変動性を低減します。 </li><li>行動の概日調節を試験するための6日目の時点（CT 1、5、9、13、17および21）で観測を行う。 </li><li>実験設計のロバスト性を増加させ、単一の実験に特異的な可変性を最小限にするために行動実験の単一のセット内の複数の時点を比較する。逆の明暗スケジュールの二つのインキュベータを同調するために使用される場合、例えば、CTおよびCT 13 1の観察とを同時に得ることができる。 注：上記の手順は、一定の暗さの概日の条件で実施したアッセイのための実験動物の調製を記載する。別の明：暗条件は、時計の機能をプローブするために使用することができるアルコールに対する行動反応中。日周リズムが実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために、LDサイクル下で行うことができる存在するかどうかを判断する。さらに、プロトコルは、概日機能障害を試験する実験のための一定の光条件下で飼育ハエと共に使用することができる。光条件に収容されたハエをテストする別のプロトコルのために、行動アッセイは、まだ暗い条件下で実施されるべきである。ハエは、行動上の光の急性影響に対する行動のばらつきを最小化するために実験前に1時間、暗所に移送しなければならない。 </li></ol> 3。行動観察根拠と概要は以下のアルコール投与プロトコルは、暗赤色灯の条件下での観察に最適化されています。 2行動対策LORRと鎮静フライ酩酊2つの異なる点を表す。 LORRは、損失Oを組み込む酩酊の遅い点を表すFモータや姿勢制御、中毒の鎮静措置に対し、非常に遅く、終点。遺伝子型または概日調節が異なるこれら2施策に影響を与える可能性があり;従って、一方は両方を検査したい場合がある。要するに、ハエがバイアル中にロードされ、LORRを表示するハエや鎮静の数は、アルコール蒸気暴露中に5分ごとに記録しており、実験終了時にカウントされたハエの総数。 <ol><li>実験を開始する前に、少なくとも10分間（空気は水とアルコールのボトルを通してバブリング）システムを介して空気を実行し、気流を較正するためにその時間を使う。 </li><li>空気の流れを停止するクイックリリースを外します。バイアル中にハエをロードし、空気の流れを再接続し、タイマーを開始します。注：応答しないか死んハエ、ハエ、保持バイアル中に残っている場合、これはストレス条件の指標とすることができる。一般に、これらの条件は、保持バイアルに少ないハエを収容又は僅かなを用いて食品の粘着性を減少させることによって緩和することができる調理中のLY高い寒天濃度。最適な行動解析と実験の間の最小の変動のために、ハエは実験前に、健康でなければなりません。 </li><li>正確な時間管理のために、アルコール暴露の総時間を追跡し、5分間隔をマークするために第2カウントバックタイマを使用する1つのタイマーを使用。 </li><li>特に暗赤色灯の条件下では、コントラストを向上させ、視認性を飛ぶためにバイアルの下に白い紙を置きます。 </li><li>一定のレベルを維持するために、実験中に定期的に空気の流れを確認してください。気流が安定した後、一般的に、彼らは実験期間中に安定した状態を保つ。 </li><li> 1時間の期間ごとに5分に一度、その立ち直り反射を失ったハエの数を数える。アルコール感度が遺伝子型および遺伝的背景の間で変化するように、より頻繁な評価を実行したり、長時間の実験を行うことが望ましい場合がある。 </li><li>バイアルslightlを持ち上げ表面からY、バイアルの背後に紙に向かって赤ライト懐中電灯からの光を演出します。暗赤色光条件下ですべての実験に1ルクスを超えない光レベルを維持するために、実験的なバイアルに少なくとも12インチの距離で、手持ちの赤懐中電灯を保管してください。 </li><li>すべての実験のための基準を確立するために照度計を用いた光のレベルを測定します。 </li><li>バイアルにしっかりとタップを適用することにより、その立ち直り反射を失ったハエの数を決定し、約4秒以内に自分を正しくすることができないどのように多くのハエ数える。 LORRを表示するハエはまだ彼らの足と羽を動かすかもしれないが、直立自らをオンにすることはできません。 </li><li>セッションの最後に、各バイアル中のハエの総数を数える。 注：実験バイアルにハエをロードする際に時折、単一のハエは、ストッパーとサイドの間に挟まれてもよい。これは暗所で行われているように、全麻痺をカウントする必要があるので、それは容易に気付かれなくてもよい正しくパーセンテージを計算するために実験終了時ハエの小胞体。 </li></ol>さらに、この手順は、異なる行動のエンドポイントを表しハエの鎮静を測定するために使用されてもよい。鎮静ハエが自分の権利反射を失ったが、鎮静、より大きなアルコール露出を必要とします。行動的に、鎮静はハエがバイアルにAA事務所タップ次のバイアル中に動か残りと見かけの運動活性の完全な欠如によって特徴づけることができる。鎮静のために、動かない足がバイアルをしっかりタップで次の配信を振っていないと残っているハエの数を数える。さらに、バイアルは、個々のハエはまだ彼らのグラブ反射を維持するかどうかを判断するために左右にロールバックすることができます。 4。データ解析<ol><li>各バイアル中のハエの総数に基づいて評価し、各時点での割合LORRを決定します。 </li><li> calculatiによる概日時点または株の違いを推定するシグモイド曲線の直線部分内にある各サンプルの50％LORRを、（下の図2を参照）ngの。 </li><li>代替統計： <ol><li>遺伝子型間の比較を計画している場合は、差が（ 図3）事後検定で有意であること時点の範囲を決定するために、反復測定ANOVAandを用いて全体の時間経過を分析することが望ましい。これらの試験のために、我々は0.001の値を使用することを好む。これは、個々の露光時間での差は、曲線の傾きの遺伝子型間の差異と同様に評価することを可能にする。 </li><li>感度の差は、このようなグラフの直線部分（ 図4）から鎮静などの特定の応答のアルコール暴露の特定の時間のために決定することができる。 </li><li>株または概日時点間の差異は、標準​​的なF-統計および事後検定を用いて推定することができる。 </li></ol></li></ol>

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R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila.">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li><li>Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biophysical+Mechanisms+of+Arousal,+Alertness,+and+Attention.">Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li><li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit.">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li><li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol.">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li><li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms.">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

アルコール乱用と社会のアルコール依存症のコストは両方の29人的·経済的コストの面で、途方もないです30,31。 ショウジョウバエをモデルとして急速に多数の個体の行動反応を調べるため、高速で汎用性の高いシステムを提供しています、そのように広くアルコール5,7,32-34及び概日研究35-37の両方に使用されてきた。 ここでは、概...

キイロショウジョウバエこの薬2,3に対する人間の応答に類似して、アルコール1に対して二相性の行動反応を示しています。 、および鎮静（応答における運動活性の完全な欠如：アルコールの低濃度への初期暴露されると、運動協調性の欠如、姿勢制御の喪失と立ち直り反射（LORR立ち直り反射の消失）に置き換えられ、展示増加自発運動を飛ぶアルコールへの暴露のような）機械的刺激には4-9進行する。内因性の概日時計は、マウス10,11、ラット12で観察されたように、アルコール感受性と毒性の強い変調器であり、13の人間。 ショウジョウバエ研究の最近の進歩により、体内時計が急性アルコール感受性ではなく、アルコール耐性1を変調を示している。突然変異体の研究と空間のトランスジェニック操作によりショウジョウバエで利用できる強力な遺伝的アプローチおよび時間的な遺伝子発現は、複雑な動作の基礎となる細胞および分子メカニズムを識別するの急速な進歩を可能にするシステムを提供する。調査ツールとしてのショウジョウバエの使用が急速に哺乳類14〜16に変換することができ、アルコール神経生物学を理解する上で実質的な進歩を可能にした。概日時計は、アルコール感受性を調節する分子メカニズムを介しての理解を容易にかつ均一に概日時点横切っ行動応答、暗赤色光の条件下で使用するのに適したアルコール投与プロトコルを測定するために必要とされる。 ショウジョウバエでは、アルコールは、慢性的暴露、または確実に急性曝露のための蒸気の形で、アルコールを投与通る食物の補給を介して投与することができる。ここでは、ロス·オブ·正向反射（LORR）1の概日調節の評価のための適切なアルコールの管理プロトコルを記述するだけでなく、鎮静。 一定の温度で12時間LDサイクル、その後、実験の質問に応じて2〜5日間、制御された光政権に転送：ハエは12時間に同伴されています。ハエは、フライバーとして知られている装置でエタノール蒸気にさらされている。この装置では、空気の制御された量は、水及びアルコールにバブリングされ;蒸気は、次いで、バイアルハウジングハエに混入し向けられる。ハエ分ごとに5は反射神経立ち直りや鎮静になっている表示されない番号を記録する。各時点についてLORRパーセンテージは概日時間ポイント間又はハエの株の間で計算され、比較される。行動分析のオプションと組み合わせるフライバーアルコール配信を使用してアルコール配信のシンプルさと信頼性は、暗い条件下で実施概日の実験のための重要な利点を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Alcohol 190 proof</td>
			<td style="width:115px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Material</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:296px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Aerator</td>
			<td style="width:115px;">Local pet store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">We use Whisper 60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Silicone tubing 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">408060-0030</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">120&#176; Y Connector</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82017-256</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Quick disconnects</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">46600-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Plastic tube clamps</td>
			<td style="width:115px;">Bell-art products</td>
			<td style="width:119px;">132250000</td>
			<td style="width:296px;">Either this or next</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8727K11</td>
			<td style="width:296px;">Either this or previous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator Mounting Bracket</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9891K66</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Gilmont size 12 flow meter</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">29895-242</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tool clips</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">1722A43</td>
			<td style="width:296px;">To hold flow meters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vial</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89092-722</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59585-186</td>
			<td style="width:296px;">Fits in vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">5 mm Pyrex Glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">PGT5x65</td>
			<td style="width:296px;">Fits best in previous stopper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">To achieve snug fit in stoppers if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59582-122</td>
			<td style="width:296px;">Fits our bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable glass pipets</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-768</td>
			<td style="width:296px;">Cut to length and bend by heating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Very fine nylon netting</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">15 watt bulbs</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Photographic red safe light filters</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Mini Flashlights with red filters</td>
			<td style="width:115px;">Mag-light</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the flybar: administering alcohol to flies

ショウジョウバエ（ ショウジョウバエ ） は 、アルコール研究とサーカディアン生物学の両方のために確立されたモデルである。最近、我々は体内時計がアルコール感受性ではなく、耐性の形成を調節することが示された。ここでは詳細に我々のプロトコルについて説明します。アルコールはフライバーを使ってハエに投与される。このセットアップでは、飽和アルコール蒸気が設定割合で加湿された空気と混合され、同時に4本のチューブ中のハエに投与する。ハエは、反復間の変動を最小にするために標準化された条件下で飼育されている。異なる遺伝子型又は治療の三日齢のハエは、好ましくは、直接比較を可能とする2つの異なる時点（ 例えば 、CTおよびCT 17 5）のハエを照合することによって、実験に使用されている。実験中、ハエはアルコール蒸気と反射（LORR）を立ち直りの損失を示すハエの数が予め決めパーセンテージに1時間さらされているか、SEDATIONは5分毎にカウントされます。データは、3つの異なる統計的アプローチを用いて分析することができる。最初は、ハエの50％が彼らの立ち直り反射を失い、有意差が時間点の間に存在するかどうかを決定するために分散分析（ANOVA）を使用していた時刻を決定することである。二つ目はANOVA分析に続いて、指定した時間（分）、後にLORRを示し割合ハエを決定することです。最後の方法は、多変量統計を使用して全体の時系列を分析することである。プロトコルはまた、遺伝子型間の非概実験や比較のために使用することができる。

マーカーとして50％LORRを使用してアルコール感度の概日調​​節。 日中のアルコール感度の概日変調を示す代表例を図2に示す。LORRはカントン-SにおけるDDの第 2日の間に6の時点で測定し、50％LORRを各時点について決定した。 （：F 5,45 = 7.39、p &lt;0.001、N = 6-10時間当たりの時点ANOVA）の分析は、一日の時間の有意な効果を示した。フィッ...

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The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

ショウジョウバエは、アルコールに対する行動反応の細胞および分子基盤を解剖するための重要なモデル系として浮上している。ここでは、簡単に他の実験に適用することができ、学部、研究に適してい概日文脈におけるアルコール感度データの収集のためのプロトコルを提示する。

フライ：ハエにアルコールを管理

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K ビュー.  Florida State University.  ショウジョウバエは、アルコールに対する行動反応の細胞および分子基盤を解剖するための重要なモデル系として浮上している。ここでは、簡単に他の実験に適用することができ、学部、研究に適してい概日文脈におけるアルコール感度データの収集のためのプロトコルを提示する。 

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Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

ラットの薬物自己投与時の超音波発声の評価

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

神経科学

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

ハエでエタノールの感度を測定するために簡単

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This is mostly due to the difficulty of microdissection of fetal brains and their sectioning for determination of apoptotic cells caused by prenatal exposure to alcohol. The experiments described here provide visualized techniques from mice breeding to the identification of cell death in fetal brain tissue. This study used C57BL/6 mice as the animal model for studying fetal alcohol exposure and the role of trophic peptide against alcohol-induced apoptosis. The breeding consists of a 2-hr matting window to determine the exact stage of embryonic age. An established fetal alcohol exposure model has been used in this study to determine the effects of prenatal alcohol exposure in fetal brains. This involves free access to alcohol or pair-fed liquid diets as the sole source of nutrients for the pregnant mice.
The techniques involving dissection of fetuses and microdissection of fetal brains are described carefully, since the latter can be challenging. Microdissection requires a stereomicroscope and ultra-fine forceps. Step-by-step procedures for dissecting the fetal brains are provided visually. The fetal brains are dissected from the base of the primordium olfactory bulb to the base of the metencephalon.
For investigating apoptosis, fetal brains are first embedded in gelatin using a peel-away mold to facilitate their sectioning with a vibratome apparatus. Fetal brains embedded and fixed in paraformaldehyde are easily sectioned, and the free floating sections can be mounted in superfrost plus slides for determination of apoptosis or cell death.
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase) assay has been used to identify cell death or apoptotic cells. It is noteworthy that apoptosis and cell-mediated cytotoxicity are characterized by DNA fragmentation. Thus, the visualized TUNEL-positive cells are indicative of cell death or apoptotic cells.
The experimental designs here provide information about the use of an established liquid diet for studying the effects of alcohol and the role of neurotrophic peptides during pregnancy in fetal brains. This involves breeding and feeding pregnant mice, microdissecting fetal brains, and determining apoptosis. Together, these visual and textual techniques might be a source for investigating prenatal exposure of harmful agents in fetal brains.

The experimental designs proposed here focus on studying the effects of alcohol exposure in apoptosis and the application of neurotrophic peptide during pregnancy in fetal brain. A detailed description from the breeding to the collection of fetal brains is described. Techniques for determination of apoptosis are also described in detail.

C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

エタノール鎮静感度との急速な寛容を測定するための安価な、スケーラブルな行動アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

の歩行速度に対するエタノールの効果を測定するためのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...