Drosophila kontrollü genetik arka planlar ve çevre koşulları altında alkol duyarlılığını hassas bir şekilde ölçebildiğiniz için alkol duyarlılığının genetik temellerini incelemek için mükemmel bir model sunar. Sinek Drosophila test gruplarında alkol duyarlılığını ölçmek için geçerli yöntemler. Çok sayıda tek sinekte alkol hassasiyetini değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek iş çıkışlı bir yöntem salıyoruz.
Drosophila'daki alkol duyarlılığındaki değişim insanlardaki benzer fenotiplere çevrilebilir çünkü sinekler genlerinin yaklaşık %75'ini insan ortologlarıyla paylaşırlar. Geliştirdiğimiz tetki, diğer sinek türleri veya hastalık vektörleri de dahil olmak üzere diğer böcekler üzerinde uçucu ların akut toksisitesinin etkilerini ölçmek için de uygulanabilir. 24 kuyulu bir hücre kültür plakası bir karton şablon oluşturarak başlayın.
Plakanın etrafını takip edin ve belirlenen alanı kesin. Sonra küçük böcek ekran örgü plaka büyüklüğünde bir parça oluşturmak için karton şablonu kullanın. 24 kuyulu bir kültür plakasının çevresine küçük bir sıcak tutkal hattı yerleştirin ve ekran örgüsünün üzerine kuyuların üzerine yapıştırın.
Sonra kültür plakası üç tarafına ahşap bir zanaat sopa güvenli sıcak tutkal tabancası kullanın. Çekim odasına sığabildiği kadar tabak hazırlayın. Çekim odasıoluşturmak için, polistiren kutusunun bir tarafında video kamera lensi büyüklüğünde bir delik ve karşı taraftaaydınlatma yastığı boyutunda ek bir yarık kesti.
Aydınlatma yastığını yarık içine yerleştirin ve kamerayı aydınlatma yastığının üzerindeki lens deliğine yerleştirin. Tüm test malzemelerini kontrollü bir ortama yerleştirin, tercihen yaklaşık %30 nem, 25 santigrat derece sıcaklık, tek tip hava akışı ve gürültü seviyesi 65 desibelden daha az olan bir davranış odasına yerleştirin. Cheesecloth iki adet kesmek için önceden yapılmış karton şablonu kullanın.
Sonra pipet her kuyuya ekran örgü ile% 100 etanol bir mililitre. Örgü kuru ve üstüne peynir bezi iki parça yerleştirin. Kısa kenarlarından birinde alanı 1-2 santimetre genişletmek için bir kılavuz olarak karton şablonu kullanarak ince, esnek, plastik kesme tahtası küçük bir parça kesin.
Kestikten sonra, plastik hala test aparatı üzerinde üç ahşap zanaat sopalar arasında uyuyor ama bir ucundan kapalı asılı olduğundan emin olun. El yazması talimatlara göre bir aspiratör hazırlayın ve esnek plastik ile daha önce emişli sinekler ile herhangi bir kuyu kapsayan, 24 kuyulu hücre kültür plaka içine iyi başına bir sinek aktarmak için kullanabilirsiniz. Her bir sineğin iyi konumunu ve ilgili genotip veya fenotip bilgilerini kaydedin.
Sinekleri içeren hücre kültürü plakasının üst kısmıyla esnek plastik floş tutun ve plakayı etanol ile değiştirilmiş hücre kültür plakasının üst kısmına ters çevirin. Ters hücre kültür plakası hizalamak için zanaat çubukları kullanın, etanol ile her iyi bir sinek içeren her iyi hizalandığından emin olun. Aydınlatma pedinin tam parlaklıkta yandığından emin olun ve video kamerayla kayıt yapmaya başlayın.
İki tabak arasındaki plastiği dikkatlice çıkararak sinekleri etanole maruz bırakarak peynir bezini çıkarmadığından emin olun. Tüm sineklerin postural kontrolünü kaybettiğinden şüphelenildiğinde, plakanın ortasına sıkıca dokunun. Hareket varsa, hiçbir hareket oluşmayana kadar her bir ila iki dakika dokunarak, kaydetmeye devam edin.
Hareket olmadığında kaydı sonlandırın. Sinekleri kurtarmak için, test cihazından üst plakayı çıkarın ve tek tek seçilen kaplara uçar. Test boyunca tutarlı etanol maruziyetini korumak için modifiye hücre kültürü plakalarında saatte en az bir kez etanol değiştirin ve deneyi istediğiniz kadar örnek için tekrarlayın.
Sinek sedasyon süresini belirlemek için video kaydını izleyin, bu da bir sineğin postural kontrolü ve lokomotor yeteneğini kaybettiği an olarak tanımlanır. Doğruluğu ndan emin olmak için filmi tersten izleyin ve sineğin hareket etmeye başladığı zamanı kaydedin. Bu yöntem, 10 dakika içinde çok sayıda sinek üzerinde veri oluşturmak için kullanılabilir.
İki 24 kuyulu plaka aynı anda alkol farklı hassasiyetleri ile iki DGRP hatları 48 bireysel sinekler için etanol sedasyon süreleri ölçmek için kullanılmıştır. Büyük numune boyutları doğruluğu artırır ve çevresel farklılıklara karşı hatayı azaltır. RAL_555 sinekler RAL-177 sineklerden daha az duyarlıydı.
RAL_177 erkekler ve dişiler cinsel olarak dimorfik bir etki göstermezken, çizgi RAL_555 dişiler etanol maruziyetine erkeklerden daha az duyarlıydı. Bu protokolü denerken, istenilen sonuca ulaşmak için sineklerin aspirasyonve hücre kültürü plakaters hassas gerçekleştirmek için çok önemlidir. Tek sinekleri değerlendirme yeteneği grup etkileşimleri nedeniyle kafa karıştırıcı etkilerden kaçındığından, bu sadron alkole maruz kalmanın akut etkileri üzerinde yüksek iş yapma çalışmaları için Drosophila modelinin yararını artırır.
